Summary

Um modelo de imagem neonatal de sepse bacteriana gram-negativa

Published: August 12, 2020
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Summary

A infecção de camundongos neonatais com bioluminescente E. coli O1:K1:H7 resulta em uma infecção séptica com inflamação pulmonar significativa e patologia pulmonar. Aqui, descrevemos procedimentos para modelar e estudar mais a sepse neonatal utilizando imagens intravitais longitudinais em paralelo com a enumeração de cargas bacterianas sistêmicas, perfil inflamatório e histopatologia pulmonar.

Abstract

Os recém-nascidos têm um risco aumentado de sepse bacteriana devido ao perfil imunológico único que apresentam nos primeiros meses de vida. Estabelecemos um protocolo para estudar a patogênese de E. coli O1:K1:H7, um sorotipo responsável pelas altas taxas de mortalidade em recém-nascidos. Nosso método utiliza imagens intravitais de filhotes neonatais em diferentes momentos durante a progressão da infecção. Essa imagem, paralelamente pela medição de bactérias no sangue, perfil inflamatório e histopatologia tecidual, significa uma abordagem rigorosa para entender a dinâmica da infecção durante a sepse. No relatório atual, modelamos dois inóculos infecciosos para comparação de cargas bacterianas e gravidade da doença. Descobrimos que a infecção subescapular leva à infecção disseminada por 10h após a infecção. Às 24 horas, a infecção da E. coli luminescente era abundante no sangue, pulmões e outros tecidos periféricos. A expressão de citocinas inflamatórias nos pulmões é significativa às 24h, sendo seguida por infiltração celular e evidência de danos teciduais que aumentam com a dose infecciosa. A imagem intravital tem algumas limitações. Isso inclui um limiar de sinal luminescente e algumas complicações que podem surgir com recém-nascidos durante a anestesia. Apesar de algumas limitações, descobrimos que nosso modelo de infecção oferece uma visão para entender a dinâmica da infecção longitudinal durante a sepse murina neonatal, que não foi completamente examinada até o momento. Esperamos que este modelo também possa ser adaptado para estudar outras infecções bacterianas críticas durante o início da vida.

Introduction

A sepse bacteriana é uma preocupação significativa para os recém-nascidos que exibem um perfil imunológico único nos primeiros dias de vida que não fornece proteção adequada contra infecção1. A sepse neonatal continua a ser um problema significativo de saúde nos EUA, representando mais de 75.000 casos anualmente apenas nos EUA2. Para estudar essas infecções em profundidade, novos modelos animais que recapitulam aspectos da doença humana são necessários. Estabelecemos um modelo de infecção por camundongos neonatais usando Escherichia coli, O1:K1:H73. E. coli é a segunda principal causa de sepse neonatal nos EUA, mas responsável pela maioria da mortalidade associada à sepse4,5. No entanto, é a principal causa quando os bebês pré-termo e muito baixo peso ao nascer (VLBW) são considerados independentemente5. O sorotipo K1 é mais frequentemente associado com infecções invasivas da corrente sanguínea e meningite em recém-nascidos6,7. Atualmente, não há outras opções de tratamento além de antibióticos e cuidados de apoio. Enquanto isso, as taxas de resistência a antibióticos continuam a aumentar para muitas bactérias patogênicas, com algumas cepas de E. coli resistentes a uma infinidade de antibióticos comumente usados no tratamento8. Assim, é imprescindível que continuemos a gerar métodos para estudar os mecanismos da sepse e a resposta do hospedeiro em recém-nascidos. Esses resultados podem ajudar a melhorar os tratamentos atuais e os desfechos de infecção.

O estado imunológico dos recém-nascidos é caracterizado por diferenças fenotípicas e funcionais em comparação com os adultos. Por exemplo, níveis elevados de citocinas anti-inflamatórias e regulatórias, como a interleucina (IL)-10 e IL-27, mostraram-se produzidas por macrófagos derivados do sangue do cordão umbilical e estão presentes em níveis maiores no soro dos recém-nascidos murinos9,10,11. Isso é consistente com níveis mais baixos de IFN-α, IFN-ɣ, IL-12 e TNF-α que são frequentemente relatados a partir de células neonatais em comparação com as contrapartes adultas10. Além disso, o sistema imunológico neonatal é inclinado para uma resposta celular T Th2 e regulamentar em comparação com adultos12. Números elevados de neutrófilos, células T, células B, células NK e monócitos também estão presentes em recém-nascidos, mas com prejuízos funcionais significativos. Isso inclui defeitos na expressão de marcadores de superfície celular e apresentação de antígeno que sugerem imaturidade13,14,15. Além disso, os neutrófilos neonatais são significativamente deficientes em sua capacidade de migrar para fatores quimotacticos16. As células supressoras derivadas de meloides (MDSCs) também são encontradas em níveis elevados em recém-nascidos e recentemente mostradas como fonte de IL-2711. Os MDSCs são altamente supressivos em relação às célulasT 17. Coletivamente, esses dados demonstram limitações na imunidade neonatal que dão ao aumento da suscetibilidade à infecção.

Para estudar a progressão da carga bacteriana e dissecar as respostas imunes protetoras durante a sepse neonatal, desenvolvemos um novo modelo de infecção. Camundongos neonatais nos dias 3-4 da vida são difíceis de injetar no espaço intraperitoneal ou veia da cauda. Em nosso modelo, dia 3 ou 4 filhotes são administrados o inóculo bacteriano ou PBS subcutâneamente na região escárcula. Uma infecção sistêmica desenvolve-se e utilizando e. coli luminescente O1:K1:H7, podemos imagem longitudinalmente de camundongos neonatais individuais para seguir a carga bacteriana disseminada em tecidos periféricos. Este é o primeiro modelo relatado para utilizar imagens intravitais para entender a cinética da disseminação de bactérias durante a sepse em recém-nascidos murinos3.

Aqui, descrevemos um protocolo para induzir infecções sépticas de E. coli em camundongos neonatais3. Descrevemos como preparar o inóculo bacteriano para injeção, e como colher tecido para avaliação da patologia, medição de marcadores inflamatórios por análise de expressão genética e enumeração da carga bacteriana. Além disso, também é descrito o uso de E. coli luminescente para imagens intravitais de recém-nascidos infectados e quantificação da matança bacteriana por células imunes neonatais. Esses protocolos também podem ser adaptados para estudar outras infecções bacterianas importantes em recém-nascidos. Os dados aqui apresentados representam uma nova abordagem geral para a compreensão da dinâmica da infecção em um modelo de sepse neonatal traduzível.

Protocol

Todos os procedimentos foram aprovados pelos Comitês Institucionais de Atenção e Uso de Animais da Virgínia Ocidental e realizados de acordo com as recomendações do Guia de Cuidado e Uso de Animais de Laboratório pelo Conselho Nacional de Pesquisa18. 1. Preparação do Inóculo Bacteriano Listrar uma placa de ágar de soja tripptic (TSA) com um laço inoculante para isolamento de uma única colônia de um estoque congelador de E. coli O1:K1:H7<…

Representative Results

Este protocolo induziu a sepse bacteriana em camundongos neonatais, e utilizamos imagens intravitais longitudinais, enumeração de bactérias no sangue, avaliações histológicas da patologia e perfis inflamatórios de expressão de citocinas para estudar o curso da doença. Foram observados sinais de morbidade em filhotes neonatais infectados com inóculos baixos (~2 x 106 CFUs) e altos (~7 x 106 UFC) de E.coli ao longo do tempo. Os filhotes que receberam o maior inóculo apresentaram si…

Discussion

Nosso modelo de infecção subscapular para induzir a sepse bacteriana em camundongos neonatais é um novo método para estudar a disseminação longitudinal de patógenos bacterianos em tempo real. A imagem intravital oferece a oportunidade de explorar a disseminação bacteriana em tempo real em recém-nascidos. Isso é fundamental para entender a cinética da disseminação bacteriana e estudar melhor a resposta e os danos do hospedeiro na fase apropriada da doença. Filhotes de rato são administrados uma injeção s…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado por fundos institucionais para c.M.R.

Materials

1 mL Insulin Syringe Coviden 1188128012 Inoculum or PBS injection
10% Neutral Buffered Formalin VWR 89370-094 Histopathology
ACK Lysis Buffer Gibco LSA1049201 Bacterial clearance assay
Animal Tattoo Ink Paste Ketchum KI1482039 Animal identification
Animal Tattoo Ink Green Paste Ketchum KI1471039 Animal identification
Anti-Ly-6B.2 Microbeads Miltenyi Biotec 130-100-781 Cell isolation
Escherichia coli O1:K1:H7 ATCC 11775
Escherichia coli O1:K1:H7-lux (expresses luciferase) N/A N/A Constructed in-house at WVU
E.Z.N.A. HP Total Extraction RNA Kit Omega Bio-tek R6812 RNA extration
DPBS, 1X Corning 21-031-CV
Difco Tryptic Soy Agar Becton, Dickinson and Company 236950 Bacterial growth
IL-1 beta Primer/Probe (Mm00434228) Thermo Fisher Scientific 4331182 Cytokine expression qPCR
IL-6 Primer/Probe (Mm00446190) Thermo Fisher Scientific 4331182 Cytokine expression qPCR
iQ Supermix Bio-Rad 1708860 Real-time quantitative PCR
iScript cDNA Synthesis Kit Bio-Rad 1708891 cDNA synthesis
Isolation Buffer Miltenyi Biotec N/A Bacterial clearance assay
IVIS Spectrum CT and Living Image 4.5 Software Perkin Elmer N/A Intravital imaging
LB Broth, Lennox Fisher BioReagents BP1427-500 Bacterial growth
EASYstrainer (Nylon Basket) Greiner Bio-one 542 040 Cell strainer
SpectraMax iD3 Molecular Devices N/A Plate reader
Pellet Pestle Motor Grainger 6HAZ6 Tissue homogenization
Polypropylene Pellet Pestles Grainger 6HAY5 Tissue homogenization
Prime Thermal Cycler Techne 3PRIMEBASE/02 cDNA synthesis
TNF-alpha Primer/Probe (Mm00443258) Thermo Fisher Scientific 4331182 Cytokine expression qPCR
TriReagent (GTCP) Molecular Research Center TR 118 RNA extration

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Seman, B. G., Povroznik, J. M., Vance, J. K., Rawson, T. W., Robinson, C. M. A Neonatal Imaging Model of Gram-Negative Bacterial Sepsis. J. Vis. Exp. (162), e61609, doi:10.3791/61609 (2020).

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