생체 발광 대장균 O1:K1:H7을 가진 신생아 마우스의 감염은 중요한 폐 염증 및 폐 병리를 가진 패혈증 감염을 초래합니다. 여기서는 전신 세균성 부담, 염증 성 프로파일링 및 폐 조직 병리학의 열거와 병행하여 세로 내 인트라비셔널 이미징을 사용하여 신생아 패혈증을 모델링하고 추가로 연구하는 절차를 설명합니다.
신생아는 삶의 첫 달에 표시되는 독특한 면역 프로필로 인해 세균 성 패혈증의 위험이 증가합니다. 우리는 신생아의 높은 사망률을 담당하는 혈청형 인 대장균 O1:K1:H7의 병인을 연구하기위한 프로토콜을 설립했습니다. 우리의 방법은 감염의 진행 도중 다른 시점에서 신생아 새끼의 인탈 화상 진찰을 이용합니다. 혈액에 있는 박테리아의 측정에 의해 병렬된 이 화상 진찰, 선동적인 프로파일링 및 조직 조직 조직 병리학, 패혈증 도중 감염 역학을 이해하는 엄격한 접근을 의미합니다. 현재 보고서에서, 우리는 세균성 부담과 질병의 엄격의 비교를 위한 2개의 전염하는 접종을 모델링합니다. 우리는 잠복 감염이 10 시간 감염에 의하여 보급된 감염으로 이끌어 내는 것을 것을을 발견합니다. 24시간까지 발광 대장균의 감염은 혈액, 폐 및 기타 말초 조직에 풍부했습니다. 폐에서 염증성 사이토카인의 발현은 24시간에서 중요하며, 이는 세포 침투와 전염성 투여량으로 증가하는 조직 손상의 증거에 선행된다. 인트라바이탈 이미징에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 이것은 발광 신호 임계값 및 마취 도중 신생아로 생길 수 있는 몇몇 합병증을 포함합니다. 몇 가지 제한에도 불구 하 고, 우리는 우리의 감염 모델 신생아 뮤린 패 혈 증 동안 세로 감염 역학을 이해 하기 위한 통찰력을 제공 발견, 그 철저 하 게 현재까지 검사 되지 않은. 우리는 이 모형이 또한 초기 생활 도중 그밖 중요한 세균성 감염을 공부하기 위하여 적응될 수 있기를 기대합니다.
세균성 패혈증은 감염1로부터적당한 보호를 제공하지 않는 생활의 첫번째 일에 있는 유일한 면역 단면도를 전시하는 신생아를 위한 중요한 관심사입니다. 신생아 패혈증은미국에서만매년 75,000건 이상의 사례를 차지하는 중요한 미국 의료 문제입니다. 심층에서 이 감염을 공부하기 위하여는, 인간적인 질병의 양상을 회상하는 새로운 동물 모형이 요구됩니다. Escherichia 대장균,O1:K1:H73을사용하여 신생아 마우스 감염 모델을 확립했습니다. 대장균은 미국에서 신생아 패혈증의 두 번째 주요 원인이지만 패혈증 관련 사망률4,5의대다수에 대한 책임이 있습니다. 그러나, 그것은 pre-term 및 매우 낮은 출생 체중 (VLBW) 아기가독립적으로5로 간주될 때 주요 한 원인입니다. K1 혈청형은 신생아6,7에서침습적 혈류 감염 및 뇌막염과 가장 자주 연관된다. 현재, 항생제와 지원 치료 이외의 다른 치료 옵션이 없습니다. 한편, 항생제 내성의 비율은 많은 병원성 박테리아에 대한 상승을 계속, 대장균의 일부 변종은 일반적으로 치료에 사용되는 항생제의 무리에 저항8. 따라서, 우리는 패혈증의 메커니즘과 신생아의 호스트 반응을 연구하는 방법을 생성하는 것이 필수적이다. 이러한 결과 현재 치료 및 감염 결과 개선 하는 데 도움이 수 있습니다.
신생아의 면역 상태는 성인에 비해 표현과 기능적 차이 모두 특징이다. 예를 들어, 인터류킨(IL)-10 및 IL-27과 같은 항염증 및 조절 세포카인의 높은 수준은, 코드 혈액 유래 대식세포에 의해 생성되는 것으로 나타났으며 뮤린 신네이트9,10,11의혈청에서 더 큰 수준에서 존재한다. 이는성인세포(10)와비교하여 신생아세포로부터 자주 보고되는 IFN-α, IFN-ɣ, IL-12 및 TNF-α 낮은 수준과 일치한다. 또한, 신생아 면역 계통은 성인12와비교하여 Th2 및 규정 T 세포 반응으로 기울어져 있다. 호중구, T 세포, B 세포, NK 세포 및 단핵구의 높은 숫자는 신생아에도 존재하지만, 중요한 기능 적 장애를 가진다. 여기에는 미성숙을 제안하는 세포 표면 마커 및 항원 프리젠 테이션의 발현에 결함이포함됩니다(13,14,15). 추가적으로, 신생아 호중구는 화학 계수 요인16로이동하는 그들의 능력에 있는 현저하게 결핍됩니다. 골수성 유래 억제제 세포(MDSC)는 또한 신네이트의 높은 수준에서 발견되며 최근에IL-2711의원천으로 나타났다. MDSC는 T세포(17)를향해 매우 억제된다. 전체적으로, 이 데이터는 감염에 증가한 감수성에 빌려주는 신생아 면제에 있는 한계를 보여줍니다.
신생아 패혈증 중 세균성 부담의 진행과 해부 보호 숙주 면역 반응의 진행을 연구하기 위해, 우리는 새로운 감염 모델을 개발했습니다. 생활의 일 3-4에 신생아 마우스는 복막 공간 또는 꼬리 정맥에서 주입하기 어렵다. 우리의 모형에서, 일 3 또는 4 새끼는 견갑각 성 지역으로 세균성 접종 또는 PBS를 피하로 관리됩니다. 전신 감염이 발생하고 발광 대장균 O1:K1:H7을 사용하여, 우리는 말초 조직에 전파된 세균 부담을 따르기 위하여 개별 신생아 마우스를 세로로 심상할 수 있습니다. 이것은 뮤린 신생아3에서패혈증 도중 박테리아의 보급의 운동을 이해하기 위하여 인트라베이티 이미징을 이용하는 첫번째 보고된 모형입니다.
여기서, 신생아 마우스에서 패혈증 대장균 감염을 유도하는 프로토콜을 설명한다3. 우리는 주입을 위한 세균성 접종을 준비하는 방법, 병리학평가를 위한 조직을 수확하는 방법, 유전자 발현 분석에 의한 염증성 마커의 측정, 세균부담의 열거를 기술합니다. 또한, 감염된 신생아의 인트랄트 이미징을 위한 발광 대장균의 사용과 신생아 면역 세포에 의한 세균성 살인의 정량화도 설명된다. 이 프로토콜은 또한 신생아에 있는 그밖 중요한 세균성 감염을 공부하기 위하여 적응될 수 있습니다. 여기에 제시된 데이터는 번역가능한 신생아 패혈증 모형에 있는 감염 역학을 이해하는 전반적인 새로운 접근을 나타냅니다.
신생아 마우스에서 세균 패혈증을 유도하기 위한 당사의 견갑골 감염 모델은 세균 병원체의 세로 확산을 실시간으로 연구하는 새로운 방법입니다. 인트라바이탈 이미징은 신생아에서 실시간으로 세균 보급을 탐구할 수 있는 기회를 제공합니다. 이것은 세균성 보급의 운동학을 이해하고 질병의 적당한 단계에서 호스트 반응 및 손상을 추가로 연구하기 위하여 중요합니다. 마우스 새끼는 세균 성 …
The authors have nothing to disclose.
이 작업은 C.M.R에 기관 자금에 의해 지원되었다.
1 mL Insulin Syringe | Coviden | 1188128012 | Inoculum or PBS injection |
10% Neutral Buffered Formalin | VWR | 89370-094 | Histopathology |
ACK Lysis Buffer | Gibco | LSA1049201 | Bacterial clearance assay |
Animal Tattoo Ink Paste | Ketchum | KI1482039 | Animal identification |
Animal Tattoo Ink Green Paste | Ketchum | KI1471039 | Animal identification |
Anti-Ly-6B.2 Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-100-781 | Cell isolation |
Escherichia coli O1:K1:H7 | ATCC | 11775 | |
Escherichia coli O1:K1:H7-lux (expresses luciferase) | N/A | N/A | Constructed in-house at WVU |
E.Z.N.A. HP Total Extraction RNA Kit | Omega Bio-tek | R6812 | RNA extration |
DPBS, 1X | Corning | 21-031-CV | |
Difco Tryptic Soy Agar | Becton, Dickinson and Company | 236950 | Bacterial growth |
IL-1 beta Primer/Probe (Mm00434228) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Cytokine expression qPCR |
IL-6 Primer/Probe (Mm00446190) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Cytokine expression qPCR |
iQ Supermix | Bio-Rad | 1708860 | Real-time quantitative PCR |
iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1708891 | cDNA synthesis |
Isolation Buffer | Miltenyi Biotec | N/A | Bacterial clearance assay |
IVIS Spectrum CT and Living Image 4.5 Software | Perkin Elmer | N/A | Intravital imaging |
LB Broth, Lennox | Fisher BioReagents | BP1427-500 | Bacterial growth |
EASYstrainer (Nylon Basket) | Greiner Bio-one | 542 040 | Cell strainer |
SpectraMax iD3 | Molecular Devices | N/A | Plate reader |
Pellet Pestle Motor | Grainger | 6HAZ6 | Tissue homogenization |
Polypropylene Pellet Pestles | Grainger | 6HAY5 | Tissue homogenization |
Prime Thermal Cycler | Techne | 3PRIMEBASE/02 | cDNA synthesis |
TNF-alpha Primer/Probe (Mm00443258) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Cytokine expression qPCR |
TriReagent (GTCP) | Molecular Research Center | TR 118 | RNA extration |