BRCA1 mutasyonu olan kişilerin kansere yakalanma riski daha yüksektir, bu da BRCA1 varyantlarının işlevinin doğru bir şekilde değerlendirilmesini garanti eder. Burada, brca1 varyantlarının canlı hücrelerde hedeflenen C:G ila T:A dönüşümünü sağlayan CRISPR aracılı sitozin baz editörleri kullanılarak işlevsel olarak değerlendirilmesi için bir protokol açıkladık.
Son çalışmalar, floresan muhabir tahlilleri, embriyonik kök hücre canlılık tahlilleri ve terapötik ilaç bazlı duyarlılık tahlilleri gibi çeşitli fonksiyonel değerlendirme yöntemlerini kullanarak BRCA1 gen mutasyonları ile ilişkili riskleri araştırmıştır. Birçok BRCA1 varyantını açıklığa kavuşturmuş olmalarına rağmen, eksojen olarak ifade edilen BRCA1 varyantlarının kullanımını içeren bu tahliller aşırı ifade sorunlarıyla ilişkilidir ve transkripsiyon sonrası düzenlemeye uygulanamaz. Bu sınırlamaları çözmek için, daha önce CRISPR aracılı sitozin baz editörü aracılığıyla BRCA1 varyantlarının fonksiyonel analizi için canlı hücrelerde hedefli nükleotid ikamesine neden olan bir yöntem bildirdik. Bu yöntemi kullanarak, işlevleri belirsiz kalan varyantlar belirledik, c.-97C>T, c.154C>T, c.3847C>T, c.5056C>T ve c.4986+5G>A dahil olmak üzere, CRISPR aracılı temel editörlerin BRCA1’debelirsiz öneme sahip varyantları yeniden sınıflandırmak için yararlı araçlar olduğunu doğruladı. Burada, CRISPR tabanlı sitozin baz editörü kullanarak BRCA1 varyantlarının işlevsel analizi için bir protokol açıklıyoruz. Bu protokol, hedef sitelerin seçimi, BRCA1 varyantlarının işlevsel analizi ve değerlendirilmesi için yönergeler sağlar.
Meme kanseri tip 1 duyarlılık geni (BRCA1) yaygın olarak bilinen bir tümör baskılayıcı gendir. BRCA1 geni DNA hasarının onarımı ile ilgili olduğundan, bu gendeki mutasyonlar bireyde daha fazla kanser gelişme riskine yol açacaktır1. Meme, yumurtalık, prostat ve pankreas kanserleri BRCA1 geninin kalıtsal fonksiyon kaybı (LOF) mutasyonları ile bağlantılıdır2. BRCA1 varyantlarının fonksiyonel olarak değerlendirilmesi ve tanımlanması, çeşitli hastalıkların önlenmesine ve teşhisine yardımcı olabilir. BRCA1 varyantlarının işlevini ele almak için, embriyonik kök hücre canlılık tahlilleri, floresan muhabir tahlilleri ve terapötik ilaç bazlı duyarlılık tahlilleri 3 ,4,5,6gibi BRCA1 varyantlarının patojenitesini araştırmak için çeşitli yöntemler geliştirilmiş ve yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu yöntemler birçok BRCA1 varyantının işlevini değerlendirmiş olsa da, eksojen olarak ifade edilen BRCA1 varyantlarını içeren yöntemler, aşağı akış regülasyonunu, gen dozajını ve protein katlamayı etkileyebilecek aşırı ekspresyon açısından sınırlamalar oluşturur7. Ayrıca, bu tahliller mRNA birleştirme, transkript stabilitesi ve çevrilmemiş bölge8,9’unetkisi gibi posttranscriptional düzenlemeye yararlanılamaz.
CRISPR-Cas9 sistemi canlı hücrelerde ve organizmalarda hedefli genom düzenlemesini sağlar10. Tek kılavuzlu bir RNA aracılığıyla Cas9, iki DNA onarım yolunu etkinleştirmek için belirli genomik locide kromozomal DNA’da çift iplikçik kırılmalarına (DSB’ ler) neden olabilir: hataya eğilimli nonhomologous end-joining (NHEJ) yolu ve hatasız homolojiye yönelik onarım (HDR) yolu11. HDR hassas bir onarım mekanizmasıdır; bununla birlikte, HDR için Cas9 çekirdeği tarafından indüklenen DSB’ler genellikle istenmeyen ekleme ve silme (indel) mutasyonuna neden olur. Ek olarak, DNA hasarını onarmak için homolog donör DNA şablonlarına ihtiyaç duyar ve nispeten düşük verimliliğe sahiptir. Son zamanlarda, Cas9 nickase (nCas9), homolog DNA şablonlarına ve DNA çift iplik kırılmalarına gerek kalmadan C:G’den T:A’ya hedeflemek için sitidin deaminaz alan adlarıyla kaynaşmıştır12,13,14,15. Sitozin baz editörunu kullanarak, BRCA1 varyantlarının fonksiyonel analizi için yeni bir yöntem geliştirdik16.
Bu çalışmada, BRCA1 varyantlarının fonksiyonel değerlendirmesini uygulamak için verimli C:G ila T:A nokta mutasyonlarına neden olan CRISPR aracılı sitozin baz editörü BE314’ükullandık ve birkaç BRCA1 varyantının işlevlerini başarıyla tanımladık (Şekil 1).
Şekil 1: İşlevsel değerlendirme için iş akışına genel bakış. (A) BRCA1’inişlevsel değerlendirmesini gösteren şematik . BRCA1 LOF’si hücre canlılığını etkilediğinden, BRCA1 mutasyonu patojenik olduğunda, geçiş sayısı arttıkça hücreler ölür. (B) BRCA1fonksiyonel değerlendirme aşamaları . Noktalı kutu isteğe bağlıdır. GRNA ekspresyonunun ko-transfeksiyon ve plazmid DNA’ları ifade eden BE3 ile değiştirilebilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Bu protokol, CRISPR meditasyonlu sitozin baz editörü kullanılarak BRCA1 varyantlarının işlevsel değerlendirmeleri için basit bir yöntemi açıklar. Protokol, hedef lokusta gRNA’ların tasarımı ve ifade edildikleri plazmid DNA’ların yapımı için yöntemleri açıklar. Sitozin temel editörleri aktif bir pencerede nükleotid dönüşümüne neden olur (BE3 durumunda, gRNA hedef dizilerinin PAM-distal ucunda nükleotidler 4-8). Araştırmacı hedef dizileri dikkatlice seçmelidir, çünkü aktif pence…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma Kore Ulusal Araştırma Vakfı tarafından desteklendi (2017M3A9B4062419, 2019R1F1A1057637 ve 2018R1A5A2020732’yi Y.K.’ye verir).
BamHI | NEB | R3136 | Restriction enzyme |
Blasticidin | Thermo Fisher Scientific | A1113903 | Drug for selecting transduced cells |
BsaI | NEB | R0535 | Restriction enzyme |
DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 | Genomic DNA prep. kit |
Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Gibco | 11965092 | Medium for HEK293T/17 cells |
Fetal bovine serum | Gibco | 16000036 | Supplemetal for cell culture |
FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | Transfection reagent |
Gibson Assembly Master Mix | NEB | E2611L | Gibson assembly kit |
Iscove’s modified Dulbecco’s medium | Gibco | 12440046 | Medium for HAP1 cells |
lentiCas9-Blast | Addgene | 52962 | Plasmids DNA for lentiBE3 cloning |
Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668027 | Transfection reagent |
Opti-MEM | Gibco | 31985070 | Transfection materials |
pCMV-BE3 | Addgene | 73021 | Plasmids DNA for lentiBE3 cloning |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140 | Supplemetal for cell culture |
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530SQ | High-fidelity polymerase |
pMD2.G | Addgene | 12259 | Plasmids DNA for virus prep. |
pRG2 | Addgene | 104174 | gRNA cloning vector |
psPAX2 | Addgene | 12260 | Plasmids DNA for virus prep. |
QIAprep Spin Miniprep kit | Qiagen | 27106 | Plasmid DNA prep. Kit |
QIAquick Gel extraction Kit | Qiagen | 28704 | Gel extraction kit |
QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | PCR product prep. kit |
Quick Ligation Kit | NEB | M2200 | Ligase for gRNA cloning |
T7 Endonuclease I | NEB | M0302 | Materials for T7E1 assay |
XbaI | NEB | R0145 | Restriction enzyme |