BRCA1突变患者患癌症的风险较高,这值得准确评估BRCA1变异的功能。在此,我们描述了使用CRISPR介质细胞素基础编辑器对BRCA1变种进行功能评估的协议,该基编辑器支持活细胞中目标C:G到T:A的转换。
最近的研究已经调查了与 BRCA1 基因突变相关的风险,使用各种功能评估方法,如荧光记者检测,胚胎干细胞可行性测定,和治疗药物的灵敏度检测。虽然它们澄清了许多 BRCA1 变种,但这些涉及使用外源表达 BRCA1 变种的检测与过度表达问题有关,不能应用于转录后调节。为了解决这些限制,我们之前报告了通过CRISPR介导细胞素基础编辑器对 BRCA1 变异进行功能分析的方法,该方法可诱导活细胞中有针对性的核苷酸替代。使用此方法,我们识别出其功能仍然模糊不清的变体, 包括 c.-97C=T、c.154C=T、c.3847C=T、c.5056C=T 和 c.4986+5G=A,并确认CRISPR介质基础编辑器是重新分类 BRCA1中不确定意义变体的有用工具。在这里,我们描述了使用基于CRISPR的细胞素基础编辑器对 BRCA1 变种进行功能分析的协议。该协议为选择目标地点、功能分析和评估 BRCA1 变种提供了准则。
乳腺癌1型易感基因(BRCA1)是一种广为人知的肿瘤抑制基因。由于BRCA1基因与DNA损伤的修复有关,该基因的突变将导致单个基因患癌症的风险更大。乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌和胰腺癌与BRCA1基因2的遗传性功能丧失(LOF)突变有关。BRCA1变种的功能评估和鉴定可能有助于预防和诊断各种疾病。为了解决BRCA1变种的功能问题,已经开发并广泛用于研究BRCA1变种的致病性,如胚胎干细胞活性测定、荧光记者检测和治疗性药物灵敏度检测3、4、5、6。虽然这些方法评估了很多BRCA1变种的功能,但涉及外源表达BRCA1变种的方法在过度表达方面存在局限性,可能会影响下游调控、基因剂量和蛋白质折叠7。此外,这些检测不能利用后脚本法规,如mRNA拼接,成绩单稳定性,以及未翻译区域8,9的影响。
CRISPR-Cas9系统使活细胞和生物体10具有针对性的基因组编辑。通过单导RNA,Cas9可以在特定基因组位点诱导染色体DNA中的双链断裂(DSBs),以激活两个DNA修复途径:易出错的非同源端连接(NHEJ)通路和无差错同源修复(HDR)通路11。HDR 是一种精确的修复机制:然而,Cas9 为 HDR 诱导的 DSB 通常会导致不需要的插入和删除 (indel) 突变。此外,它需要同源捐赠者DNA模板来修复DNA损伤,效率相对较低。最近,Cas9 nickase (nCas9) 已与细胞丁去氨酶域融合,用于定位 C:G 到 T:A 替换,无需均匀的 DNA 模板和 DNA 双链断裂 12、13、14、15。利用细胞素基础编辑器,我们开发出一种对BRCA1变种16进行功能分析的新方法。
在这项研究中,我们使用CRISPR介导细胞素基础编辑器,BE314,它诱导有效的C:G到T:A点突变,用于实施BRCA1变异的功能评估,并成功识别了几个BRCA1变种的功能(图1)。
图1:功能评估工作流程概述。(A) 显示 BRCA1功能评估的示意图。因为 BRCA1 的LOF影响细胞的生存能力,当 BRCA1 突变是致病的,细胞死亡的通道数增加。(B) BRCA1功能评估的阶段。点缀框是可选的。它可以被 gRNA 表达和 BE3 表达质粒 DNA 的共变性所取代。 请点击这里查看此数字的较大版本。
此协议描述了使用CRISPR冥想细胞素基础编辑器对 BRCA1 变种进行功能评估的简单方法。该协议描述了在目标位置设计 gRNA 的方法,以及从中表达的质粒 DNA 的构建方法。细胞素基础编辑器在活动窗口中诱导核苷酸转换(如果 BE3,核苷酸 4-8 在 GRNA 目标序列的 PAM-分端)。研究人员应该仔细选择目标序列,因为活动窗口中的所有细胞氨酸都可以代替胸腺素。此外,正如第 5 步所述,应仔细分析?…
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了韩国国家研究基金会的支持(赠款2017M3A9B4062419,2019R1F1A1057637和2018R1A5A2020732到Y.K.)。
BamHI | NEB | R3136 | Restriction enzyme |
Blasticidin | Thermo Fisher Scientific | A1113903 | Drug for selecting transduced cells |
BsaI | NEB | R0535 | Restriction enzyme |
DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 | Genomic DNA prep. kit |
Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Gibco | 11965092 | Medium for HEK293T/17 cells |
Fetal bovine serum | Gibco | 16000036 | Supplemetal for cell culture |
FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | Transfection reagent |
Gibson Assembly Master Mix | NEB | E2611L | Gibson assembly kit |
Iscove’s modified Dulbecco’s medium | Gibco | 12440046 | Medium for HAP1 cells |
lentiCas9-Blast | Addgene | 52962 | Plasmids DNA for lentiBE3 cloning |
Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668027 | Transfection reagent |
Opti-MEM | Gibco | 31985070 | Transfection materials |
pCMV-BE3 | Addgene | 73021 | Plasmids DNA for lentiBE3 cloning |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140 | Supplemetal for cell culture |
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530SQ | High-fidelity polymerase |
pMD2.G | Addgene | 12259 | Plasmids DNA for virus prep. |
pRG2 | Addgene | 104174 | gRNA cloning vector |
psPAX2 | Addgene | 12260 | Plasmids DNA for virus prep. |
QIAprep Spin Miniprep kit | Qiagen | 27106 | Plasmid DNA prep. Kit |
QIAquick Gel extraction Kit | Qiagen | 28704 | Gel extraction kit |
QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | PCR product prep. kit |
Quick Ligation Kit | NEB | M2200 | Ligase for gRNA cloning |
T7 Endonuclease I | NEB | M0302 | Materials for T7E1 assay |
XbaI | NEB | R0145 | Restriction enzyme |