Le persone con mutazioni BRCA1 hanno un rischio più elevato di sviluppare il cancro, il che giustifica una valutazione accurata della funzione delle varianti BRCA1. Nel presente documento, abbiamo descritto un protocollo per la valutazione funzionale delle varianti BRCA1 utilizzando editor di base citosina mediati da CRISPR che consentono la conversione da C:G a T:A mirata nelle celle viventi.
Studi recenti hanno studiato i rischi associati alle mutazioni geniche BRCA1 utilizzando vari metodi di valutazione funzionale come test fluorescenti dei reporter, test di vitalità delle cellule staminali embrionali e test terapeutici di sensibilità a base di farmaci. Sebbene abbiano chiarito molte varianti brca1, questi test che coinvolgono l’uso di varianti BRCA1 espresse esogenamente sono associati a problemi di sovraespressione e non possono essere applicati alla regolamentazione post-trascrizionale. Per risolvere queste limitazioni, abbiamo precedentemente segnalato un metodo per l’analisi funzionale delle varianti BRCA1 tramite l’editor di base di citosina mediato da CRISPR che induce una sostituzione mirata dei nucleotidi nelle cellule viventi. Utilizzando questo metodo, abbiamo identificato varianti le cui funzioni rimangono ambigue, tra cui c.-97C>T, c.154C>T, c.3847C>T, c.5056C>T e c.4986+5G>A, e abbiamo confermato che gli editor di base mediati da CRISPR sono strumenti utili per riclassificare le varianti di significato incerto in BRCA1. Qui, descriviamo un protocollo per l’analisi funzionale delle varianti BRCA1 utilizzando l’editor di base citosina basato su CRISPR. Questo protocollo fornisce linee guida per la selezione dei siti di destinazione, l’analisi funzionale e la valutazione delle varianti BRCA1.
Il gene della suscettibilità al cancro al seno di tipo 1(BRCA1)è un gene soppressore tumorale ampiamente noto. Poiché il gene BRCA1 è correlato alla riparazione del danno al DNA, le mutazioni in questo gene porterebbero a un maggiore rischio di sviluppo del cancro in unindividuo 1. I tumori al seno, alle ovaie, alla prostata e al pancreas sono legati a mutazioni ereditarie della perdita di funzione (LOF) del gene BRCA1 2. La valutazione funzionale e l’identificazione delle varianti BRCA1 possono aiutare a prevenire e diagnosticare le varie malattie. Per affrontare la funzione delle varianti BRCA1, sono stati sviluppati diversi metodi e ampiamente utilizzati per indagare la patogenicità delle varianti BRCA1 come test di vitalità delle cellule staminali embrionali, test fluorescenti dei reporter e test terapeutici di sensibilità a base di farmaci3,4,5,6. Sebbene questi metodi abbiano valutato la funzione di molte varianti BRCA1, i metodi che coinvolgono varianti BRCA1 espresse esogenamente pongono limitazioni in termini di sovraespressione che potrebbero influenzare la regolazione a valle, il dosaggio genico e il ripiegamento proteico7. Inoltre, questi saggi non possono essere sfruttati per la regolazione posttrascrizionale come l’affezione dell’mRNA, la stabilità della trascrizione e l’effetto della regionenon tradotta 8,9.
Il sistema CRISPR-Cas9 consente un editing mirato del genoma nelle cellule viventi e negliorganismi 10. Attraverso un RNA a guida singola, Cas9 può indurre rotture a doppio filamento (DSB) nel DNA cromosomico a loci genomici specifici al fine di attivare due percorsi di riparazione del DNA: percorso di terminazione non disomologa (NHEJ) soggetto a errori e percorso di riparazione diretta dall’omologia (HDR) privo dierrori 11. L’HDR è un meccanismo di riparazione preciso; tuttavia, i DSB indotti dalla nucleasi Cas9 per HDR spesso si trae da mutazione indesiderata di inserimento ed eliminazione (indele). Inoltre, ha bisogno di modelli di DNA donatori omologhi per riparare i danni al DNA e ha un’efficienza relativamente bassa. Recentemente, la nickasi Cas9 (nCas9) è stata fusa con domini di deaminasi citidina per indirizzare le sostituzioni da C:G a T:A, senza la necessità di modelli di DNA omologhi e rotture a doppio filamento di DNA12,13,14,15. Utilizzando l’editor di base citosina, abbiamo sviluppato un nuovo metodo per l’analisi funzionale delle varianti BRCA116.
In questo studio, abbiamo utilizzato l’editor di base di citosina mediato da CRISPR, BE314, che induce mutazioni puntili efficienti da C:G a T:A, per implementare la valutazione funzionale delle varianti BRCA1 e ha identificato con successo le funzioni di diverse varianti BRCA1 (Figura 1).
Figura 1: Panoramica del flusso di lavoro per la valutazione funzionale. (A) Schema che mostra la valutazione funzionale di BRCA1. Poiché l’LOF di BRCA1 influisce sulla vitalità cellulare, quando la mutazione BRCA1 è patogena, le cellule muoiono all’aumentare del numero di passaggi. (B) Fasi della valutazione funzionale della BRCA1. La casella punteggiata è facoltativa. Può essere sostituito dalla co-trasfezione del GRNA che esprime e BE3 che esprime DNA di plasmidi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Questo protocollo descrive un metodo semplice per le valutazioni funzionali delle varianti BRCA1 utilizzando l’editor di base citosina meditato da CRISPR. Il protocollo descrive i metodi per la progettazione di gRNA al locus bersaglio e la costruzione dei DNA plasmidici da cui sono espressi. Gli editor di base citosina inducono la conversione nucleotidica in una finestra attiva (nel caso di BE3, nucleotidi 4-8 nell’estremità pam-distale delle sequenze bersaglio del gRNA). Il ricercatore dovrebbe scegliere atten…
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Research Foundation of Korea (sovvenzioni 2017M3A9B4062419, 2019R1F1A1057637 e 2018R1A5A2020732 a Y.K.).
BamHI | NEB | R3136 | Restriction enzyme |
Blasticidin | Thermo Fisher Scientific | A1113903 | Drug for selecting transduced cells |
BsaI | NEB | R0535 | Restriction enzyme |
DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 | Genomic DNA prep. kit |
Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Gibco | 11965092 | Medium for HEK293T/17 cells |
Fetal bovine serum | Gibco | 16000036 | Supplemetal for cell culture |
FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | Transfection reagent |
Gibson Assembly Master Mix | NEB | E2611L | Gibson assembly kit |
Iscove’s modified Dulbecco’s medium | Gibco | 12440046 | Medium for HAP1 cells |
lentiCas9-Blast | Addgene | 52962 | Plasmids DNA for lentiBE3 cloning |
Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668027 | Transfection reagent |
Opti-MEM | Gibco | 31985070 | Transfection materials |
pCMV-BE3 | Addgene | 73021 | Plasmids DNA for lentiBE3 cloning |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140 | Supplemetal for cell culture |
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530SQ | High-fidelity polymerase |
pMD2.G | Addgene | 12259 | Plasmids DNA for virus prep. |
pRG2 | Addgene | 104174 | gRNA cloning vector |
psPAX2 | Addgene | 12260 | Plasmids DNA for virus prep. |
QIAprep Spin Miniprep kit | Qiagen | 27106 | Plasmid DNA prep. Kit |
QIAquick Gel extraction Kit | Qiagen | 28704 | Gel extraction kit |
QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | PCR product prep. kit |
Quick Ligation Kit | NEB | M2200 | Ligase for gRNA cloning |
T7 Endonuclease I | NEB | M0302 | Materials for T7E1 assay |
XbaI | NEB | R0145 | Restriction enzyme |