Las personas con mutaciones BRCA1 tienen un mayor riesgo de desarrollar cáncer, lo que garantiza una evaluación precisa de la función de las variantes brca1. En este documento, describimos un protocolo para la evaluación funcional de variantes BRCA1 utilizando editores base de citosina mediadas por CRISPR que permiten la conversión de C:G a T:A dirigida en células vivas.
Estudios recientes han investigado los riesgos asociados con las mutaciones del gen BRCA1 utilizando varios métodos de evaluación funcional, como ensayos de reporteros fluorescentes, ensayos embrionarios de viabilidad de células madre y ensayos terapéuticos de sensibilidad basada en fármacos. Aunque han aclarado muchas variantes brca1, estos ensayos que implican el uso de variantes BRCA1 expresadas exógenamente están asociados con problemas de sobreexpresión y no se pueden aplicar a la regulación post-transcripcional. Para resolver estas limitaciones, anteriormente informamos de un método de análisis funcional de variantes BRCA1 a través del editor base de citosina mediada por CRISPR que inducen la sustitución de nucleótidos dirigidos en células vivas. Utilizando este método, identificamos variantes cuyas funciones siguen siendo ambiguas, incluyendo c.-97C>T, c.154C>T, c.3847C>T, c.5056C>T y c.4986+5G>A, y confirmó que los editores base mediados por CRISPR son herramientas útiles para reclasificar las variantes de importancia incierta en BRCA1. Aquí, describimos un protocolo para el análisis funcional de variantes BRCA1 utilizando el editor base de citosina basado en CRISPR. Este protocolo proporciona directrices para la selección de sitios de destino, análisis funcional y evaluación de variantes BRCA1.
El gen de susceptibilidad tipo 1 del cáncer de mama(BRCA1)es un gen supresor tumoral ampliamente conocido. Debido a que el gen BRCA1 está relacionado con la reparación del daño del ADN, las mutaciones en este gen conducirían a un mayor riesgo de desarrollo del cáncer en un individuo1. Los cánceres de mama, ovario, próstata y páncreas están relacionados con mutaciones hereditarias de pérdida de función (LOF) del gen BRCA1 2. La evaluación funcional y la identificación de las variantes brca1 pueden ayudar a prevenir y diagnosticar las diversas enfermedades. Para abordar la función de las variantes BRCA1, se han desarrollado varios métodos y utilizados ampliamente para investigar la patogenicidad de variantes BRCA1 como ensayos embrionarios de viabilidad de células madre, ensayos de reportero fluorescente y ensayos terapéuticos de sensibilidad basada en fármacos3,4,5,6. Aunque estos métodos han evaluado la función de una gran cantidad de variantes BRCA1, los métodos que implican variantes BRCA1 expresadas exógenamente plantean limitaciones en términos de sobreexpresión que podrían afectar a la regulación aguas abajo, dosis de genes, y plegado de proteínas7. Además, estos ensayos no pueden aprovecharse para el reglamento posttranscriptional, como el empalme del ARNM, la estabilidad de la transcripción y el efecto de la región no traducida8,9.
El sistema CRISPR-Cas9 permite la edición selectiva del genoma en células y organismos vivos10. A través de un ARN mono guía, Cas9 puede inducir roturas de doble hebra (DSB) en adn cromosómico en loci genómico específico con el fin de activar dos vías de reparación del ADN: vía de unión final nohomologous (NHEJ) propensa a errores y vía11de reparación dirigida por homología sin errores (HDR). HDR es un mecanismo de reparación preciso; sin embargo, los DSB inducidos por la nucleasa Cas9 para HDR a menudo resultan en una mutación no deseada de inserción y eliminación (indel). Además, necesita plantillas homologosas de ADN de donantes para reparar el daño del ADN y tiene una eficiencia relativamente baja. Recientemente, Cas9 nickase (nCas9) se han fusionado con dominios desaminases de citidina para apuntar a sustituciones de C:G a T:A, sin necesidad de plantillas de ADN homologosas y roturas de doble hebra de ADN12,13,14,15. Utilizando el editor base de citosina, desarrollamos un nuevo método para el análisis funcional de las variantes BRCA116.
En este estudio, utilizamos el editor base de citosina mediada por CRISPR, BE314, que induce mutaciones eficientes de punto C:G a T:A, para implementar la evaluación funcional de las variantes BRCA1 e identificar con éxito las funciones de varias variantes BRCA1 (Figura 1).
Figura 1: Una visión general del flujo de trabajo para la evaluación funcional. (A) Esquema que muestra la evaluación funcional de BRCA1. Debido a que el LOF de BRCA1 afecta la viabilidad celular, cuando la mutación BRCA1 es patógena, las células mueren a medida que aumenta el número de pasajes. B) Etapas de la evaluación funcional de BRCA1. El cuadro punteado es opcional. Puede ser reemplazado por la co-transfección de la expresión de GRNA y BE3 expresando ADN plásmidos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Este protocolo describe un método simple para evaluaciones funcionales de variantes BRCA1 utilizando el editor base de citosina meditado por CRISPR. El protocolo describe los métodos para el diseño de gRNAs en el locus objetivo y la construcción de los DNAs plásmidos a partir de los cuales se expresan. Los editores base de citosina inducen la conversión de nucleótidos en una ventana activa (en el caso de BE3, nucleótidos 4–8 en el extremo PAM-distal de las secuencias de destino de gRNA). El investigado…
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Investigación de Corea (subvenciones 2017M3A9B4062419, 2019R1F1A1057637, y 2018R1A5A2020732 a Y.K.).
BamHI | NEB | R3136 | Restriction enzyme |
Blasticidin | Thermo Fisher Scientific | A1113903 | Drug for selecting transduced cells |
BsaI | NEB | R0535 | Restriction enzyme |
DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 | Genomic DNA prep. kit |
Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Gibco | 11965092 | Medium for HEK293T/17 cells |
Fetal bovine serum | Gibco | 16000036 | Supplemetal for cell culture |
FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | Transfection reagent |
Gibson Assembly Master Mix | NEB | E2611L | Gibson assembly kit |
Iscove’s modified Dulbecco’s medium | Gibco | 12440046 | Medium for HAP1 cells |
lentiCas9-Blast | Addgene | 52962 | Plasmids DNA for lentiBE3 cloning |
Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668027 | Transfection reagent |
Opti-MEM | Gibco | 31985070 | Transfection materials |
pCMV-BE3 | Addgene | 73021 | Plasmids DNA for lentiBE3 cloning |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140 | Supplemetal for cell culture |
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530SQ | High-fidelity polymerase |
pMD2.G | Addgene | 12259 | Plasmids DNA for virus prep. |
pRG2 | Addgene | 104174 | gRNA cloning vector |
psPAX2 | Addgene | 12260 | Plasmids DNA for virus prep. |
QIAprep Spin Miniprep kit | Qiagen | 27106 | Plasmid DNA prep. Kit |
QIAquick Gel extraction Kit | Qiagen | 28704 | Gel extraction kit |
QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | PCR product prep. kit |
Quick Ligation Kit | NEB | M2200 | Ligase for gRNA cloning |
T7 Endonuclease I | NEB | M0302 | Materials for T7E1 assay |
XbaI | NEB | R0145 | Restriction enzyme |