Sağlam hücrelerde aday inhibitörleri tarafından hedef nişan değerlendirmek için yeteneği ilaç keşfi için çok önemlidir. Bu protokol, vahşi tip SHP2 veya onkojenik varyantlarını hedefleyen inhibitörlerin hücresel hedef etkileşimini güvenilir bir şekilde algılayan 384 iyi biçimli hücresel termal değişim testini tanımlar.
PTPN11 proto-onkogen tarafından kodlanmış Src-homology 2 (SH2) etki alanı içeren fosfataz 2 (SHP2), hücre sağkalım ını ve çoğalmasını teşvik eden, reseptör tirozin kinaz (RTK) güdümlü hücre sinyalinin önemli bir aracısıdır. Buna ek olarak, SHP2 B ve T hücre aktivasyonunu inhibe etmek için bağışıklık kontrol noktası reseptörleri tarafından işe. Anormal SHP2 fonksiyonu birçok kanserin gelişimi, ilerlemesi ve metastazında yer almıştır. Nitekim, küçük molekül SHP2 inhibitörleri son ras / Raf / ERK yolu aktivasyonu ile katı tümörlerin tedavisi için klinik çalışmalara girmiştir, bazı onkojenik Ras mutasyonları ile tümörler de dahil olmak üzere. Ancak, SHP2 inhibitörlerinin mevcut sınıf lösemilerde sık görülen SHP2 onkojenik varyantlarına karşı etkili değildir ve onkojenik SHP2’yi hedefleyen spesifik küçük moleküllerin gelişimi güncel araştırmanın konusudur. SHP2 gibi sitosolik proteinleri içeren çoğu ilaç keşif kampanyaları ile ortak bir sorun, birincil tahliller bu sürücü kimyasal keşif genellikle in vitro tahliller aday bileşiklerin hücresel hedef nişan rapor yok olmasıdır. Hücresel hedef etkileşimini ölçmek için bir platform sağlamak için hem vahşi tip hem de mutant SHP2 hücresel termal değişim tahlilleri geliştirdik. Bu tahliller, hücrelerdeki SHP2 inhibitörlerinin hedef katılımını güvenilir bir şekilde algılar. Burada, SHP2 inhibitörlerinin değerlendirilmesi ve karakterizasyonu için değerli bir araç sağlayan bu testin kapsamlı bir protokolünü salıyoruz.
Tirozin fosforilasyon hücrelerde sinyal transdüksiyon önemli bir rol oynar1,2. Bu post-translational modifikasyon protein tirozin kinazları (PtKs) tarafından katalize edilir ve protein tirozin fosfatazlar (PtPs) tarafından tersine çevrilir. Bu nedenle, anormal PTK veya PTP fonksiyonu birçok kalıtsal veya edinilmiş insan hastalıkları3yol açar,4,5,6. Src-homology 2 (SH2) etki alanı içeren fosfataz 2 (SHP2) yaygın olarak ifade edilen non-reseptör tipi PTP proto-oncogene PTPN117 tarafından kodlanmış ve Ras / Raf / ERK, PI3K / Akt veya JAK / STAT sinyal yollarıaktivasyonuile sinyal transdüksiyon içeren çok sayıda fizyolojik süreçlerin önemli bir düzenleyici 8 . Normalde, SHP2 aktivitesi anormal sinyalizasyonönlemek için sıkı bir şekilde düzenlenir. Bazal koşullar altında SHP2, katalitik fosfataz etki alanı içinde aktif bölgeye erişimi engelleyen N-terminal SH2 etki alanı tarafından otomatik olarak engellenir (Şekil 1A)9,10. Hücre aktivasyonu üzerine, tirozin fosforlu bağlayıcı proteinler SHP2’yi işe alır ve aktif alan artık alt tabakalarına erişebildiği aktif konformasyonunu benimsemesine neden olur. Birçok kanserde SHP2 aktivitesi yükselir. PTPN11’deki somatik fonksiyon kazanım (GOF) mutasyonları daha çok lösemilerde tespit edilmiştir ve N-SH2 etki alanının fosfataz etki alanına bağlanmasını önleyerek kurucu olarak aktif SHP2(Şekil 1B)11ile sonuçlanmıştır. PTPN11’deki Germline GOF mutasyonları Noonan sendromu olgularının ~%50’si, malignite riski yüksek bir gelişimsel bozukluktan sorumludur12. PTPN11 mutasyonlarının nadir olduğu solid tümörlerde, fosforilasyonlu bağlayıcı proteinlerin daha yüksek düzeyleri gelişmiş SHP2 aktivitesine yol açar(Şekil 1C). SHP2 de bağışıklık kontrol noktası sinyalizasyonu için önemlidir, BTLA veya PD-1 gibi kontrol noktası reseptörleri gibi anahtar sinyal molekülleri defosforilasyon için shp2 işe, bağışıklık hücresi aktivasyonunu önlemek13,14,15.
PtP’lerin aktif alanı yüksek oranda korunmuş ve yüksek oranda şarj edildiği için, PtP’lerin küçük moleküllerle hedeflanması zor olmuştur; aktif site hedef inhibitörleri genellikle güçlü, ama kötü seçicilik ve oral biyoyararlanım sergiler16,17,18,19,20,21,22.18 Nitekim, birçok rapor SHP2 inhibitörleri kötü seçicilik ve hücrelerde etkinlik eksikliği muzdarip23. Son zamanlarda, iyi potens ve mükemmel seçicilik ile SHP2 allosteric inhibitörleri bildirilmiştir (örneğin, SHP09924 ve RMC-455025)ve SHP2 inhibitörleri yenilenen ilgi yol açtı. Bileşikler SHP099 ve RMC-4550 dayalı şu anda faz I klinik çalışmalarda reseptör tirozin kinaz ile katı tümörleri tedavi etmek için (RTK) yolu aktivasyon26,27. Çığır açan iken, Bu bileşikler kan kanseri hastalarının önemli sayıda lökemogenez sürücü SHP2 onkojenik mutantların çoğuna karşıetkisizdir28,29,30. SHP2 onkojenik varyantlarına doğru SHP2 benzeri bileşiklerin bu potens eksikliği, SHP2 mutantlarında bozulan inaktif, kapalı konformasyonu bağlayarak ve stabilize ederek SHP2 aktivitesini inhibe ettikleri için, benzersiz allosterik mekanizmalarından kaynaklanmaktadır. Ayrıca, yeni bir rapora dayanarak31, SHP099 benzeri inhibitörleri ile tedavi hastalarda adaptif direnç mekanizmaları oldukça akla yatkındır. Sonuç olarak, aktif, açık durumunu hedefleyen yeni nesil SHP2 inhibitörlerinin geliştirilmesi yoğun bir araştırma konusudur.
Hücrelerde yeni SHP2 inhibitörlerinin karakterizasyonu kurşun optimizasyon sürecinin önemli bir yönüdür. Kritik, fizyolojik koşullar altında inhibitörü kanıtlanmış hedef nişan tıbbi kimya için kaynakların verimli verici hücresel etkinliği ile bileşikler üzerinde dağıtılan ek bir güven düzeyi sağlar. Geçmişte, küçük molekül inhibitörlerinin hedeflerine bağlanmasını değerlendirmek için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir, öncelikle protein kinazları için32. Bir SHP2 hücresel hedef nişan analizi geliştirmek için, bir hücresel termal vardiya analizi33kullandı. Bu test, proteinler için in vitro termal shift benzer (PTS) test34, genellikle küçük moleküllerin bağlanması ile değiştirilir hedef protein termal stabilite, izler. Orijinal testi hedef protein düzeylerini ölçmek için antikorlar kullanan düşük bir iş testidir. Alternatif olarak, bir β-galaktosidaz enzim parça tamamlayıcılığı (EFC) analizi(Şekil 2)35kullanan termal kayma analizinin yakın zamanda bildirilen bir varyantını seçtik. Bu deneyler için, ilgi protein gelişmiş bir ProLabel etiketi taşıyan bir N- veya C-terminal füzyon proteini olarak hücrelerde ifade edilir (ePL, β-galaktosidaz bir 42 amino asit parçası). Hücreler daha sonra 384-iyi PCR uyumlu plakalar aktarılır ve ilgi bileşikleri ile kuluçkaya yatırılır. Bir termocycler proteinleri denature ve sıcaklık ısı stabilitesine bağlı olarak arttıkça agrega olacak hücrelere bir sıcaklık gradyan uygulamak için kullanılır. Bir aday bileşiğin ilgi proteinini bağlayıp stabilize edebilme yeteneği, o proteinin termal stabilitesinin artmasına neden olacaktır. Bu nedenle, hücrelerin lysis aşağıdaki, bir aday bileşik tarafından stabilize edilmiş bu etiketli proteinler araç kontrolü ile kuluçka hücrelerinetiketli proteinler daha yüksek sıcaklıklarda çözelti kalacaktır. Muhabir enzim kabul edici (EA) çözünür ePL etiketli proteinleri tamamlayarak, lüminesans substratı kullanılarak saptanabilir β-galaktosidaz aktivitesi ile sonuçlanır.
Yakın zamanda yabani tip SHP2 (SHP2-WT) ve sık shp2 onkojenik varyant (SHP2-E76K) için sağlam bir hücresel termal vardiya tayini geliştirdik minyatür leştirilmiş 384-iyiformat36. Burada, hücrelerdeki SHP2 inhibitörleri tarafından hedef etkileşimini güvenilir bir şekilde algılayan ve inhibitör potens ile hücresel termal değişim verileri arasında yüksek derecede korelasyon gösteren bu testin ayrıntılı bir protokolünü rapor ediyoruz. Genel titreiş akışı Şekil 3’tegösterilmiştir. Platformumuz n-terminally etiketli tam uzunlukta ePL-SHP2 füzyon proteinleri kullanır. İlgili pICP-ePL-N-SHP2-WT ve pICP-ePL-N-SHP2-E76K ifade plazmidleri üretimi için lütfen son yayın36bakın . Bu töz, SHP2 termal profillerini oluşturmak ve inhibitörün varlığında veya yokluğunda SHP2 erime sıcaklıklarını belirlemek için bir termal degrade kullanılarak gerçekleştirilebilir. Termal profiller kurulduktan sonra, aynı zamanda inhibisyon doz-yanıt değerlendirmesi sağlayan, izotermal koşullar altında yapılabilir. Her iki deney türü de aşağıda açıklanmıştır.
Küçük moleküllerin hücrelerdeki SHP2 fosfatazına doğrudan bağlanmasını doğrulayabilecek bir hedef nişan analizi sunduk. Taht, düşük ve yüksek afisite inhibitörleri arasında ayrım yapabilir ve daha da önemlisi GOF onkojenik SHP2-E76K mutantı için SHP099 tipi allosterik inhibitörlerin potens eksikliğini doğrulayabilir. Bu minyatür leştirilmiş tayini bir gücü bir SHP2 inhibitörü tarama kampanyasına entegre edilebilir yeteneğidir. Tdenemenin bilinmeyen kimyasal madde ile SHP2’ye hücre içi …
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma National Institutes of Health Grant 1R21CA195422 (L.T.’ ye), Epstein Aile Vakfı Ödülü (N.D. P. .C.) ve NCI Kanser Merkezi Destek Hibesi P30CA030199 tarafından desteklendi. Ayrıca, bu proje tamamen veya kısmen Ulusal Kanser Enstitüsü, Ulusal Sağlık Enstitüleri, Kimyasal Biyoloji Konsorsiyumu Sözleşme No altında Federal fonlar ile finanse edilmiştir. HHSN261200800001E. Bu yayının içeriği, Sağlık ve İnsan Iúletmeleri Bakanlığı’ nın görüşlerini veya politikalarını yansıtmadığı gibi, ticari adlardan, ticari ürünlerden veya kuruluşlardan bahsetmek DE ABD Hükümeti tarafından onaylandığı anlamına gelmez. İçerik sadece yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitüleri’nin resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir.
384-well gradient equipped thermocycler | Eppendorf AG | X50h | |
384-well low dead volume microplate Echo qualified | Beckman Coulter, Inc. | LP-0200 | |
6-well cell culture plates | Greiner Bio-One | 657 160 | Sterile with lid |
Antibiotic-Antimycotic (Anti Anti) 100 X | Thermo Fisher Scientific | 15240-062 | |
Cell counter | Thermo Fisher Scientific | Countess II FL | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium 1X + GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 10566-016 | 500 mL |
Echo acoustic liquid handler | Beckman Coulter, Inc. | Echo 550 | |
Electronic multichannel pipette | Thermo Fisher Scientific | E1 ClipTip | |
Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 26140-079 | 500 mL |
HEPES buffer | Thermo Fisher Scientific | 15630-680 | 100 mL |
InCell Pulse starter kit | Eurofins DiscoverX Corp. | 94-4007 | Components include EA buffer, lysis buffer, and substrate |
Microplate reader | Tecan Trading AG | Spark | |
Single channel solution trough | Thermo Fisher Scientific | S253012005 | |
Sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360-010 | 100 mM |
Thermal microplate sealer | Agilent Technologies, Inc. | PlateLoc | |
Transfection reagents | Polyplus Transfection | jetPRIME | |
Trypan blue | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
TrypLE Express reagent | Thermo Fisher Scientific | 12605-010 | |
Twin.tec 384 real-time PCR plates | Eppendorf AG | 30132734 |