Bewertung des zellulären Zielengagements durch SHP2 (PTPN11) Phosphatase-Inhibitoren
Summary
Die Fähigkeit, das Zielengagement von Kandidateninhibitoren in intakten Zellen zu bewerten, ist entscheidend für die Entdeckung von Arzneimitteln. Dieses Protokoll beschreibt einen 384 gut formatierten zellulären thermischen Schichttest, der zuverlässig die zelluläre Zielinteraktion von Inhibitoren erkennt, die entweder auf Den Wildtyp SHP2 oder seine onkogenen Varianten abzielen.
Abstract
Die vom PTPN11 Proto-Onkogen kodierte Src-Homologie 2 (SH2) ist ein wichtiger Vermittler der Rezeptor-Tyrosinkinase (RTK)-gesteuerte Zellsignalisierung, die das Überleben und die Proliferation von Zellen fördert. Darüber hinaus wird SHP2 von Immun-Check-Point-Rezeptoren rekrutiert, um die Aktivierung von B- und T-Zellen zu hemmen. Aberrant SHP2 Funktion wurde in die Entwicklung, Progression, und Metastasierung vieler Krebsarten beteiligt. Tatsächlich sind kleine Molekül-SHP2-Inhibitoren kürzlich in klinische Studien zur Behandlung von soliden Tumoren mit Ras/Raf/ERK-Signalwegaktivierung eingetreten, einschließlich Tumoren mit einigen onkogenen Ras-Mutationen. Jedoch, die aktuelle Klasse der SHP2-Inhibitoren ist nicht wirksam gegen die SHP2 onkogene Varianten, die häufig bei Leukämien auftreten, und die Entwicklung von spezifischen kleinen Molekülen, die oncogenic SHP2 zielen, ist das Thema der aktuellen Forschung. Ein häufiges Problem mit den meisten Arzneimittel-Entdeckungskampagnen mit zytosolischen Proteinen wie SHP2 ist, dass die primären Assays, die chemische Entdeckung vorantreiben, oft In-vitro-Assays sind, die nicht über das zelluläre Zielengagement von Kandidatenverbindungen berichten. Um eine Plattform zur Messung des zellulären Zielengagements zu bieten, haben wir sowohl Wildtyp- als auch mutierte SHP2-Zell-Thermoschicht-Assays entwickelt. Diese Assays detektieren zuverlässig die Zielinteraktion von SHP2-Inhibitoren in Zellen. Hier stellen wir ein umfassendes Protokoll dieses Assays zur Verfügung, das ein wertvolles Werkzeug für die Bewertung und Charakterisierung von SHP2-Inhibitoren darstellt.
Introduction
Tyrosin-Phosphorylierung spielt eine wichtige Rolle bei der Signaltransduktion in den Zellen1,2. Diese posttranslationale Modifikation wird durch Protein-Tyrosin-Kinasen (PTKs) katalysiert und durch Protein-Tyrosinphosphatasen (PTP) umgekehrt. Daher führt abnorme PTK- oder PTP-Funktion zu vielen vererbten oder erworbenen menschlichen Krankheiten3,4,5,6. Die Src-homology 2 (SH2) domänenhaltige Phosphatase 2 (SHP2) ist ein weit verbreiteter Nicht-Rezeptor-Typ PTP, der vom Proto-Onkogen PTP117 kodiert wird und ein wichtiger Regulator zahlreicher physiologischer Prozesse ist, die Signaltransduktion durch Aktivierung der Ras/Raf/ERK,PI3K/Akt oder JAK/STAT-Signalwege8beinhalten. Normalerweise ist die SHP2-Aktivität streng reguliert, um eine abnorme Signalisierung zu verhindern. Unter basalen Bedingungen wird SHP2 durch seine N-Terminal-DOMÄNE SH2 automatisch gehemmt, die den Zugriff auf den aktiven Standort innerhalb der katalytischen Phosphatase-Domäne blockiert (Abbildung 1A)9,10. Bei der Zellaktivierung rekrutieren Tyrosinphosphorylbindungsproteine SHP2, wodurch es seine aktive Konformation annimmt, bei der die aktive Stelle nun für ihre Substrate zugänglich ist. Bei vielen Krebsarten ist die SHP2-Aktivität erhöht. Somatische Gain-of-Function-Mutationen (GOF) in PTPN11 wurden hauptsächlich bei Leukämien identifiziert und verhindern die Bindung der N-SH2-Domäne an die Phosphatase-Domäne, was zu konstitutiv aktivem SHP2 (Abbildung 1B)11 führt. Germline GOF-Mutationen in PTPN11 sind verantwortlich für 50% der Fälle von Noonan-Syndrom, eine Entwicklungsstörung mit einem erhöhten Risiko für Malignität12. Bei soliden Tumoren, bei denen PTPN11-Mutationen selten sind, führen höhere Konzentrationen phosphorylierter Bindungsproteine zu einer verbesserten SHP2-Aktivität (Abbildung 1C). SHP2 ist auch wichtig für die Immun-Checkpoint-Signalisierung, da Checkpoint-Rezeptoren wie BTLA oder PD-1 SHP2 rekrutieren, um wichtige Signalmoleküle zu dephosphorisieren und die Aktivierung von Immunzellen zu verhindern13,14,15.
Die Ausrichtung von PTPs mit kleinen Molekülen war eine Herausforderung, da die aktive Stelle von PTPs hochkonserviert und hoch aufgeladen ist; Inhibitoren, die auf die aktive Stelle abzielen, sind oft potent, weisen jedoch eine schlechte Selektivität und orale Bioverfügbarkeitauf 16,17,18,19,20,21,22. Tatsächlich leiden viele berichtete SHP2-Hemmer an schlechter Selektivität und mangelnder Wirksamkeit in den Zellen23. Kürzlich wurden allosterische Inhibitoren von SHP2 mit guter Potenz und ausgezeichneter Selektivität berichtet (z. B. SHP09924 und RMC-455025) und haben erneutes Interesse an SHP2-Inhibitoren geweckt. Verbindungen auf Basis von SHP099 und RMC-4550 befinden sich derzeit in klinischen Phase-I-Studien zur Behandlung solider Tumoren mit Rezeptor-Tyrosinkinase (RTK) Signalwegaktivierung26,27. Während wegweisend, Diese Verbindungen sind unwirksam gegen viele der SHP2 onkogene Erbmutanten, die Leukemogenese bei einer signifikanten Anzahl von Blutkrebspatienten28,29,30. Dieser Mangel an Potenz von SHP099-ähnlichen Verbindungen gegenüber den sHP2 onkogenen Varianten ergibt sich aus ihrem einzigartigen allosterischen Mechanismus, da sie die SHP2-Aktivität hemmen, indem sie die inaktive, geschlossene Konformation binden und stabilisieren, die in SHP2-Mutanten gestört wird. Darüber hinaus sind auf der Grundlage eines aktuellen Berichts31adaptive Resistenzmechanismen bei Patienten, die mit SHP099-ähnlichen Inhibitoren behandelt wurden, durchaus denkbar. Folglich ist die Entwicklung von SHP2-Inhibitoren der nächsten Generation, die auf ihren aktiven, offenen Zustand abzielen, Gegenstand intensiver Forschung.
Die Charakterisierung neuartiger SHP2-Inhibitoren in Zellen ist ein wesentlicher Aspekt des Lead-Optimierungsprozesses. Entscheidend ist, dass das bewährte Zielengagement des Inhibitors unter physiologischen Bedingungen ein zusätzliches Maß an Vertrauen dafür bietet, dass Ressourcen für die medizinische Chemie effizient auf Verbindungen mit vielversprechender zellulärer Wirksamkeit eingesetzt werden. In der Vergangenheit wurden mehrere Methoden zur Beurteilung der Bindung kleiner Molekülinhibitoren an ihre Targets entwickelt, vor allem für Proteinkianasen32. Um einen SHP2-Zellziel-Engagement-Assay zu entwickeln, haben wir einen zellulären thermischen Schichttest33verwendet. Dieser Assay, ähnlich wie der In-vitro-Thermoshift-Assay (PTS) für Proteine34, überwacht die thermische Stabilität des Zielproteins, die typischerweise durch die Bindung kleiner Moleküle verändert wird. Der ursprüngliche Assay ist ein Test mit niedrigem Durchsatz, der Antikörper nutzt, um den Zielproteinspiegel zu quantifizieren. Alternativ haben wir uns für eine kürzlich gemeldete Variante des thermischen Schicht-Assays entschieden, die eine β-Galactosidase-Enzymfragmentkomplementierung (EFC) verwendet (Abbildung 2)35. Für diese Experimente wird das Protein von Interesse in Zellen als N- oder C-terminales Fusionsprotein mit einem verbesserten ProLabel-Tag (ePL, einem 42-Aminosäure-Fragment von β-Galactosidase) ausgedrückt. Die Zellen werden dann auf 384-Well-PCR-kompatible Platten übertragen und mit verbindungen von Interesse inkubiert. Ein Thermocycler wird verwendet, um einen Temperaturgradienten auf die Zellen anzuwenden, deren Proteine denaturieren und aggregieren, wenn die Temperatur aufgrund ihrer thermischen Stabilität steigt. Die Fähigkeit einer Kandidatenverbindung, das Protein von Interesse zu binden und zu stabilisieren, führt zu einer erhöhten thermischen Stabilität dieses Proteins. Daher bleiben nach der Lyse der Zellen die getaggten Proteine, die durch eine Kandidatenverbindung stabilisiert wurden, bei höheren Temperaturen in Lösung als markierte Proteine von Zellen, die mit Fahrzeugkontrolle inkubiert werden. Reporter-Enzym-Akzeptor (EA) ist in der Lage, die löslichen ePL-markierten Proteine zu ergänzen, was zu einer nachweisbaren β-Galactosidase-Aktivität mit einem Lumineszenzsubstrat führt.
Wir haben vor kurzem einen robusten zellulären thermischen Schichttest für Wildtyp SHP2 (SHP2-WT) und eine häufige SHP2 onkogene Variante (SHP2-E76K) in einem miniaturisierten 384-Well-Format36entwickelt. Hier berichten wir über ein detailliertes Protokoll dieses Assays, das das Zielengagement von SHP2-Inhibitoren in Zellen zuverlässig erkennt und einen hohen Grad an Korrelation zwischen Inhibitor-Potenz und zellulären thermischen Schichtdaten aufzeigt. Der allgemeine Assay-Workflow ist in Abbildung 3dargestellt. Unsere Plattform verwendet N-terminalmarkierte ePL-SHP2-Fusionsproteine in voller Länge. Zur Erzeugung der entsprechenden pICP-ePL-N-SHP2-WT und pICP-ePL-N-SHP2-E76K Expressionsplasmide finden Sie in unserer aktuellen Publikation36. Dieser Test kann mit einem thermischen Gradienten durchgeführt werden, um SHP2-Thermoprofile zu erstellen und SHP2-Schmelztemperaturen in Gegenwart oder Abwesenheit von Inhibitoren zu bestimmen. Sobald thermische Profile erstellt wurden, kann es auch unter isothermen Bedingungen durchgeführt werden, so dass Inhibitor Dosis-Wirkungs-Bewertung. Beide Arten von Experimenten werden im Folgenden beschrieben.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir haben einen Ziel-Engagement-Assay vorgestellt, der die direkte Bindung kleiner Moleküle an die SHP2-Phosphatase in Zellen bestätigen kann. Der Test kann zwischen niedrigen und hohen Affinitätshemmern unterscheiden und, was wichtig ist, einen Mangel an Wirksamkeit durch die allosterischen Inhibitoren des SHP099-Typs für die GOF onkogene SHP2-E76K Mutant bestätigen. Eine Stärke dieses miniaturisierten Assays ist seine Fähigkeit, in eine SHP2-Hemmer-Screening-Kampagne integriert zu werden. Die Fähigkeit des Assa…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde unterstützt von National Institutes of Health Grant 1R21CA195422 (an L. T.), Epstein Family Foundation Award (an N. D. P.C.) und NCI Cancer Center Support Grant P30CA030199. Darüber hinaus wurde dieses Projekt ganz oder teilweise mit Bundesmitteln des National Cancer Institute, National Institutes of Health, im Rahmen des Chemical Biology Consortium Contract No finanziert. HHSN261200800001E. Der Inhalt dieser Veröffentlichung spiegelt nicht unbedingt die Ansichten oder Richtlinien des Department of Health and Human Services wider, noch impliziert die Erwähnung von Handelsnamen, kommerziellen Produkten oder Organisationen eine Billigung durch die US-Regierung. Der Inhalt liegt allein in der Verantwortung der Autoren und stellt nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health dar.
Materials
| 384-well gradient equipped thermocycler | Eppendorf AG | X50h | |
| 384-well low dead volume microplate Echo qualified | Beckman Coulter, Inc. | LP-0200 | |
| 6-well cell culture plates | Greiner Bio-One | 657 160 | Sterile with lid |
| Antibiotic-Antimycotic (Anti Anti) 100 X | Thermo Fisher Scientific | 15240-062 | |
| Cell counter | Thermo Fisher Scientific | Countess II FL | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium 1X + GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 10566-016 | 500 mL |
| Echo acoustic liquid handler | Beckman Coulter, Inc. | Echo 550 | |
| Electronic multichannel pipette | Thermo Fisher Scientific | E1 ClipTip | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 26140-079 | 500 mL |
| HEPES buffer | Thermo Fisher Scientific | 15630-680 | 100 mL |
| InCell Pulse starter kit | Eurofins DiscoverX Corp. | 94-4007 | Components include EA buffer, lysis buffer, and substrate |
| Microplate reader | Tecan Trading AG | Spark | |
| Single channel solution trough | Thermo Fisher Scientific | S253012005 | |
| Sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360-010 | 100 mM |
| Thermal microplate sealer | Agilent Technologies, Inc. | PlateLoc | |
| Transfection reagents | Polyplus Transfection | jetPRIME | |
| Trypan blue | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| TrypLE Express reagent | Thermo Fisher Scientific | 12605-010 | |
| Twin.tec 384 real-time PCR plates | Eppendorf AG | 30132734 |
References
- Hunter, T. Tyrosine phosphorylation: thirty years and counting. Current Opinion in Cell Biology. 21 (2), 140-146 (2009).
- Alonso, A., et al. Protein tyrosine phosphatases in the human genome. Cell. 117 (6), 699-711 (2004).
- Cohen, P. Protein kinases-the major drug targets of the twenty-first century. Nature Reviews Drug Discovery. 1 (4), 309 (2002).
- Ferguson, F. M., Gray, N. S. Kinase inhibitors: the road ahead. Nature Reviews: Drug Discovery. 17 (5), 353-377 (2018).
- Stanford, S. M., Bottini, N. Targeting Tyrosine Phosphatases: Time to End the Stigma. Trends in Pharmacological Sciences. 38 (6), 524-540 (2017).
- Tonks, N. Protein tyrosine phosphatases–from housekeeping enzymes to master regulators of signal transduction. FEBS Journal. 280 (2), 346-378 (2013).
- Chan, R., Feng, G. PTPN11 is the first identified proto-oncogene that encodes a tyrosine phosphatase. Blood. 109 (3), 862-867 (2007).
- Chan, G., Kalaitzidis, D., Neel, B. The tyrosine phosphatase Shp2 (PTPN11) in cancer. Cancer Metastasis Rev. 27 (2), 179-192 (2008).
- Hof, P., Pluskey, S., Dhe-Paganon, S., Eck, M., Shoelson, S. Crystal structure of the tyrosine phosphatase SHP-2. Cell. 92 (4), 441-450 (1998).
- Barford, D., Neel, B. Revealing mechanisms for SH2 domain mediated regulation of the protein tyrosine phosphatase SHP-2. Structure. 6 (3), 249-254 (1998).
- Neel, B. G., Chan, G., Dhanji, S. . Handbook of Cell Signaling (Second Edition). 2, 771-809 (2010).
- Tartaglia, M., et al. Mutations in PTPN11, encoding the protein tyrosine phosphatase SHP-2, cause Noonan syndrome. Nature Genetics. 29 (4), 465-468 (2001).
- Yokosuka, T., et al. Programmed cell death 1 forms negative costimulatory microclusters that directly inhibit T cell receptor signaling by recruiting phosphatase SHP2. Journal of Experimental Medicine. 209 (6), 1201-1217 (2012).
- Okazaki, T., Maeda, A., Nishimura, H., Kurosaki, T., Honjo, T. PD-1 immunoreceptor inhibits B cell receptor-mediated signaling by recruiting src homology 2-domain-containing tyrosine phosphatase 2 to phosphotyrosine. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (24), 13866-13871 (2001).
- Watanabe, N., et al. BTLA is a lymphocyte inhibitory receptor with similarities to CTLA-4 and PD-1. Nature Immunology. 4 (7), 670-679 (2003).
- Bialy, L., Waldmann, H. Inhibitors of protein tyrosine phosphatases: next-generation drugs. Angewandte Chemie International Edition England. 44 (25), 3814-3839 (2005).
- Kumar, S., Liang, F., Lawrence, D., Zhang, Z. Small molecule approach to studying protein tyrosine phosphatase. Methods. 35 (1), 9-21 (2005).
- Tautz, L., Pellecchia, M., Mustelin, T. Targeting the PTPome in human disease. Expert Opinion in Thereapeutics Targets. 10 (1), 157-177 (2006).
- Tautz, L., Mustelin, T. Strategies for developing protein tyrosine phosphatase inhibitors. Methods. 42 (3), 250-260 (2007).
- Vintonyak, V., Antonchick, A., Rauh, D., Waldmann, H. The therapeutic potential of phosphatase inhibitors. Current Opinion in Chemical Biology. 13 (3), 272-283 (2009).
- Barr, A. Protein tyrosine phosphatases as drug targets: strategies and challenges of inhibitor development. Future Medicinal Chemistry. 2 (10), 1563-1576 (2010).
- He, R., Zeng, L., He, Y., Zhang, S., Zhang, Z. Small molecule tools for functional interrogation of protein tyrosine phosphatases. FEBS Journal. 280, 731-750 (2012).
- Tsutsumi, R., Ran, H., Neel, B. G. Off-target inhibition by active site-targeting SHP2 inhibitors. FEBS Open Biology. 8 (9), 1405-1411 (2018).
- Chen, Y. N., et al. Allosteric inhibition of SHP2 phosphatase inhibits cancers driven by receptor tyrosine kinases. Nature. 535 (7610), 148-152 (2016).
- Nichols, R. J., et al. RAS nucleotide cycling underlies the SHP2 phosphatase dependence of mutant BRAF-, NF1- and RAS-driven cancers. Nature Cell Biology. 20 (9), 1064-1073 (2018).
- . Clinical Trial NCT03114319 Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03114319?term=NCT03114319_rank=1 (2019)
- . Clinical Trial NCT03634982 Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03114319?term=NCT03634982_rank=1 (2019)
- Sun, X., et al. Selective inhibition of leukemia-associated SHP2(E69K) mutant by the allosteric SHP2 inhibitor SHP099. Leukemia. 32 (5), 1246-1249 (2018).
- LaRochelle, J. R., et al. Structural reorganization of SHP2 by oncogenic mutations and implications for oncoprotein resistance to allosteric inhibition. Nature Communication. 9 (1), 4508 (2018).
- Padua, R. A. P., et al. Mechanism of activating mutations and allosteric drug inhibition of the phosphatase SHP2. Nature Communication. 9 (1), 4507 (2018).
- Lu, H., et al. Resistance to allosteric SHP2 inhibition in FGFR-driven cancers through rapid feedback activation of FGFR. Oncotarget. 11 (3), 265-281 (2020).
- Smyth, L. A., Collins, I. Measuring and interpreting the selectivity of protein kinase inhibitors. Journal of Chemical Biology. 2 (3), 131-151 (2009).
- Martinez Molina, D., et al. Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay. Science. 341 (6141), 84-87 (2013).
- Ericsson, U., Hallberg, B., Detitta, G., Dekker, N., Nordlund, P. Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies. Analytical Biochemistry. 357 (2), 289-298 (2006).
- McNulty, D. E., et al. A High-Throughput Dose-Response Cellular Thermal Shift Assay for Rapid Screening of Drug Target Engagement in Living Cells, Exemplified Using SMYD3 and IDO1. SLAS Discovery. 23 (1), 34-46 (2018).
- Romero, C., et al. A cellular target engagement assay for the characterization of SHP2 (PTPN11) phosphatase inhibitors. Journal of Biological Chemistry. 295 (9), 2601-2613 (2020).
- Ran, H., Tsutsumi, R., Araki, T., Neel, B. G. Sticking It to Cancer with Molecular Glue for SHP2. Cancer Cell. 30 (2), 194-196 (2016).
