Evaluación del compromiso de objetivos celulares por inhibidores de la fosfatasa SHP2 (PTPN11)
Summary
La capacidad de evaluar la participación objetivo de los inhibidores candidatos en las células intactas es crucial para el descubrimiento de fármacos. Este protocolo describe un ensayo de cambio térmico celular de formato de 384 pozos que detecta de forma fiable el compromiso de destino celular de inhibidores dirigidos a SHP2 de tipo salvaje o sus variantes oncogénicas.
Abstract
La fosfatasa 2 (SHP2) que contiene dominio Src-homología 2), codificada por el protooncogene PTPN11, es un mediador clave de la señalización celular impulsada por la tirosina quinasa del receptor (RTK), promoviendo la supervivencia y proliferación celular. Además, SHP2 es reclutado por receptores de punto de control inmune para inhibir la activación de células B y T. La función aberrante SHP2 se ha implicado en el desarrollo, progresión y metástasis de muchos tipos de cáncer. De hecho, los inhibidores de SHP2 de moléculas pequeñas han entrado recientemente en ensayos clínicos para el tratamiento de tumores sólidos con activación de la vía Ras/Raf/ERK, incluidos tumores con algunas mutaciones rasgénicas oncogénicas. Sin embargo, la clase actual de inhibidores SHP2 no es eficaz contra las variantes oncogénicas SHP2 que ocurren con frecuencia en las leucemias, y el desarrollo de moléculas pequeñas específicas que se dirigen a SHP2 oncogénico es objeto de investigación actual. Un problema común con la mayoría de las campañas de descubrimiento de fármacos que involucran proteínas citosólicas como SHP2 es que los ensayos primarios que impulsan el descubrimiento químico son a menudo ensayos in vitro que no reportan la participación de la diana celular de los compuestos candidatos. Para proporcionar una plataforma para medir el compromiso de objetivos celulares, desarrollamos ensayos de desplazamiento térmico celular SHP2 de tipo salvaje y mutante. Estos ensayos detectan de forma fiable la participación objetivo de los inhibidores de SHP2 en las células. Aquí, proporcionamos un protocolo integral de este ensayo, que proporciona una herramienta valiosa para la evaluación y caracterización de los inhibidores de SHP2.
Introduction
La fosforilación de tirosina desempeña un papel importante en la transducción de señales en las células1,2. Esta modificación post-traduccional es catalizada por proteínas tirosina quinasas (PTK) y revertida por proteínas tirosina fosfatasas (PTP). Por lo tanto, la función aberrante PTK o PTP conduce a muchas enfermedades humanas heredadas o adquiridas3,4,5,6. La fosfatasa 2 (SHP2) que contiene dominios Src-homología 2 (SHP2) es un PTP de tipo no receptor ampliamente expresado codificado por el proto-oncogene PTPN117 y es un regulador clave de numerosos procesos fisiológicos que implican la transducción de señales por activación de las vías de señalización Ras/Raf/ERK, PI3K/Akt o JAK/STAT8. Normalmente, la actividad de SHP2 está estrechamente regulada para evitar la señalización aberrante. En condiciones basales, SHP2 es autoinhibitado por su dominio SH2 del terminal N, que bloquea el acceso al sitio activo dentro del dominio catalítico de fosfatasa (Figura 1A)9,10. Tras la activación celular, las proteínas de unión fosforiladas de tirosina reclutan SHP2, lo que hace que adopte su conformación activa, en la que el sitio activo es ahora accesible a sus sustratos. En muchos tipos de cáncer, la actividad de SHP2 es elevada. Las mutaciones somáticas de ganancia de función (GOF) en PTPN11 se han identificado principalmente en las leucemias y evitan la unión del dominio N-SH2 al dominio de la fosfatasa, lo que resulta en SHP2(Figura 1B)11constitutivamente activo. Las mutaciones de Germline GOF en PTPN11 son responsables del 50% de los casos de síndrome de Noonan, un trastorno del desarrollo con un mayor riesgo de neoplasia maligna12. En los tumores sólidos, donde las mutaciones de PTPN11 son raras, mayores niveles de proteínas de unión fosforiladas conducen a una mayor actividad de SHP2 (Figura 1C). SHP2 también es importante para la señalización de puntos de control inmune, ya que los receptores de punto de control como BTLA o PD-1 reclutan SHP2 para desfosforilar moléculas clave de señalización, evitando la activación de células inmunitarias13,,14,,15.
Apuntar a los PTP con moléculas pequeñas ha sido un desafío, porque el sitio activo de los PTP está altamente conservado y altamente cargado; inhibidores que apuntan al sitio activo son a menudo potentes, pero exhiben mala selectividad y biodisponibilidad oral16,17,18,19,20,21,22. De hecho, muchos inhibidores de SHP2 reportados sufren de mala selectividad y falta de eficacia en las células23. Recientemente, se han notificado inhibidores alostéricos de SHP2 con buena potencia y excelente selectividad (por ejemplo, SHP09924 y RMC-455025)y han despertado un renovado interés en los inhibidores de SHP2. Los compuestos basados en SHP099 y RMC-4550 se encuentran actualmente en ensayos clínicos de fase I para tratar tumores sólidos con activación de la vía de tirosina quinasa receptora (RTK)26,,27. Mientras que innovadores, estos compuestos son ineficaces contra muchos de los mutantes oncogénicos SHP2 que impulsan la leukemogénesis en un número significativo de pacientes con cáncer de sangre28,,29,30. Esta falta de potencia de los compuestos similares a SHP099 hacia las variantes oncogénicas SHP2 se deriva de su mecanismo alostérico único, ya que inhiben la actividad de SHP2 al unir y estabilizar la conformación inactiva y cerrada, que se interrumpe en los mutantes SHP2. Además, sobre la base de un informe reciente31,los mecanismos de resistencia adaptativa en pacientes tratados con inhibidores similares a SHP099 son bastante concebibles. En consecuencia, el desarrollo de inhibidores SHP2 de próxima generación que se dirigen a su estado activo y abierto es un tema de intensa investigación.
La caracterización de nuevos inhibidores de SHP2 en las células es un aspecto esencial del proceso de optimización del plomo. Críticamente, el compromiso objetivo probado del inhibidor en condiciones fisiológicas proporciona un nivel adicional de confianza de que los recursos para la química medicinal se despliegan eficientemente en compuestos con eficacia celular prometedora. En el pasado, se han desarrollado varios métodos para evaluar la unión de inhibidores de moléculas pequeñas a sus objetivos, principalmente para las quinasas proteicas32. Para desarrollar un ensayo de compromiso de objetivo celular SHP2, utilizamos un ensayo de desplazamiento térmico celular33. Este ensayo, similar al ensayo de desplazamiento térmico in vitro (PTS) para proteínas34, supervisa la estabilidad térmica de la proteína objetivo, que normalmente se ve alterada por la unión de moléculas pequeñas. El ensayo original es un ensayo de bajo rendimiento que utiliza anticuerpos para cuantificar los niveles de proteína objetivo. Alternativamente, elegimos una variante recientemente reportada del ensayo de cambio térmico que utiliza un ensayo de β-galactosidasa en forma de fragmentos de enzima (EFC)(Figura 2)35. Para estos experimentos, la proteína de interés se expresa en las células como una proteína de fusión N o C-terminal que lleva una etiqueta ProLabel mejorada (ePL, un fragmento de 42 aminoácidos de β-galactosidasa). Las células se transfieren a placas compatibles con PCR de 384 pozos y se incuban con compuestos de interés. Un termociclador se utiliza para aplicar un gradiente de temperatura a las células, cuyas proteínas desnaturalizarán y se agregarán a medida que la temperatura aumenta en función de su estabilidad térmica. La capacidad de un compuesto candidato para unir y estabilizar la proteína de interés resultará en una mayor estabilidad térmica de esa proteína. Por lo tanto, después de la lysis de las células, las proteínas etiquetadas que han sido estabilizadas por un compuesto candidato permanecerán en solución a temperaturas más altas que las proteínas etiquetadas de las células incubadas con el control del vehículo. El aceptador de enzimas reporter (EA) es capaz de complementar las proteínas solubles etiquetadas con ePL, lo que resulta en una actividad detectable β-galactosidasa utilizando un sustrato de luminiscencia.
Recientemente desarrollamos un robusto ensayo de cambio térmico celular para SHP2 de tipo salvaje (SHP2-WT) y una variante oncogénica SHP2 frecuente (SHP2-E76K) en un formato miniaturizado de 384pozos 36. Aquí, informamos de un protocolo detallado de este ensayo, que detecta de forma fiable el compromiso de destino por parte de los inhibidores de SHP2 en las células y demuestra un alto grado de correlación entre la potencia del inhibidor y los datos de desplazamiento térmico celular. El flujo de trabajo de ensayo general se ilustra en la Figura 3. Nuestra plataforma utiliza proteínas de fusión ePL-SHP2 con la etiqueta N-terminal. Para la generación de los plásmidos de expresión pICP-ePL-N-SHP2-WT y pICP-ePL-N-SHP2-E76K correspondientes, consulte nuestra reciente publicación36. Este ensayo se puede realizar utilizando un gradiente térmico para establecer perfiles térmicos SHP2 y determinar las temperaturas de fusión de SHP2 en presencia o ausencia de inhibidor. Una vez establecidos los perfiles térmicos, también se puede realizar en condiciones isotérmicas, lo que permite la evaluación de la dosis-respuesta del inhibidor. Ambos tipos de experimentos se describen a continuación.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hemos presentado un ensayo de compromiso objetivo que puede confirmar la unión directa de moléculas pequeñas a la fosfatasa SHP2 en las células. El ensayo puede discriminar entre inhibidores de baja y alta afinidad y, lo que es más importante, confirmar la falta de potencia por parte de los inhibidores alostéricos del tipo SHP099 para el mutante SHP2-E76K oncogénico DEL GOF. Una fortaleza de este ensayo miniaturizado es su capacidad para integrarse en una campaña de detección de inhibidores de SHP2. La capacidad…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la Beca de los Institutos Nacionales de Salud 1R21CA195422 (a L. T.), el Premio de la Fundación de la Familia Epstein (a N. D. P.C.), y la Beca de Apoyo al Centro Oncológico NCI P30CA030199. Además, este proyecto ha sido financiado total o parcialmente con fondos federales del Instituto Nacional del Cáncer, Institutos Nacionales de Salud, bajo el Contrato No. del Consorcio de Biología Química. HHSN261200800001E. El contenido de esta publicación no refleja necesariamente las opiniones o políticas del Departamento de Salud y Servicios Humanos, ni la mención de nombres comerciales, productos comerciales u organizaciones implica la aprobación por parte del Gobierno de los Estados Unidos. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales de los Institutos Nacionales de Salud.
Materials
| 384-well gradient equipped thermocycler | Eppendorf AG | X50h | |
| 384-well low dead volume microplate Echo qualified | Beckman Coulter, Inc. | LP-0200 | |
| 6-well cell culture plates | Greiner Bio-One | 657 160 | Sterile with lid |
| Antibiotic-Antimycotic (Anti Anti) 100 X | Thermo Fisher Scientific | 15240-062 | |
| Cell counter | Thermo Fisher Scientific | Countess II FL | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium 1X + GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 10566-016 | 500 mL |
| Echo acoustic liquid handler | Beckman Coulter, Inc. | Echo 550 | |
| Electronic multichannel pipette | Thermo Fisher Scientific | E1 ClipTip | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 26140-079 | 500 mL |
| HEPES buffer | Thermo Fisher Scientific | 15630-680 | 100 mL |
| InCell Pulse starter kit | Eurofins DiscoverX Corp. | 94-4007 | Components include EA buffer, lysis buffer, and substrate |
| Microplate reader | Tecan Trading AG | Spark | |
| Single channel solution trough | Thermo Fisher Scientific | S253012005 | |
| Sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360-010 | 100 mM |
| Thermal microplate sealer | Agilent Technologies, Inc. | PlateLoc | |
| Transfection reagents | Polyplus Transfection | jetPRIME | |
| Trypan blue | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| TrypLE Express reagent | Thermo Fisher Scientific | 12605-010 | |
| Twin.tec 384 real-time PCR plates | Eppendorf AG | 30132734 |
References
- Hunter, T. Tyrosine phosphorylation: thirty years and counting. Current Opinion in Cell Biology. 21 (2), 140-146 (2009).
- Alonso, A., et al. Protein tyrosine phosphatases in the human genome. Cell. 117 (6), 699-711 (2004).
- Cohen, P. Protein kinases-the major drug targets of the twenty-first century. Nature Reviews Drug Discovery. 1 (4), 309 (2002).
- Ferguson, F. M., Gray, N. S. Kinase inhibitors: the road ahead. Nature Reviews: Drug Discovery. 17 (5), 353-377 (2018).
- Stanford, S. M., Bottini, N. Targeting Tyrosine Phosphatases: Time to End the Stigma. Trends in Pharmacological Sciences. 38 (6), 524-540 (2017).
- Tonks, N. Protein tyrosine phosphatases–from housekeeping enzymes to master regulators of signal transduction. FEBS Journal. 280 (2), 346-378 (2013).
- Chan, R., Feng, G. PTPN11 is the first identified proto-oncogene that encodes a tyrosine phosphatase. Blood. 109 (3), 862-867 (2007).
- Chan, G., Kalaitzidis, D., Neel, B. The tyrosine phosphatase Shp2 (PTPN11) in cancer. Cancer Metastasis Rev. 27 (2), 179-192 (2008).
- Hof, P., Pluskey, S., Dhe-Paganon, S., Eck, M., Shoelson, S. Crystal structure of the tyrosine phosphatase SHP-2. Cell. 92 (4), 441-450 (1998).
- Barford, D., Neel, B. Revealing mechanisms for SH2 domain mediated regulation of the protein tyrosine phosphatase SHP-2. Structure. 6 (3), 249-254 (1998).
- Neel, B. G., Chan, G., Dhanji, S. . Handbook of Cell Signaling (Second Edition). 2, 771-809 (2010).
- Tartaglia, M., et al. Mutations in PTPN11, encoding the protein tyrosine phosphatase SHP-2, cause Noonan syndrome. Nature Genetics. 29 (4), 465-468 (2001).
- Yokosuka, T., et al. Programmed cell death 1 forms negative costimulatory microclusters that directly inhibit T cell receptor signaling by recruiting phosphatase SHP2. Journal of Experimental Medicine. 209 (6), 1201-1217 (2012).
- Okazaki, T., Maeda, A., Nishimura, H., Kurosaki, T., Honjo, T. PD-1 immunoreceptor inhibits B cell receptor-mediated signaling by recruiting src homology 2-domain-containing tyrosine phosphatase 2 to phosphotyrosine. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (24), 13866-13871 (2001).
- Watanabe, N., et al. BTLA is a lymphocyte inhibitory receptor with similarities to CTLA-4 and PD-1. Nature Immunology. 4 (7), 670-679 (2003).
- Bialy, L., Waldmann, H. Inhibitors of protein tyrosine phosphatases: next-generation drugs. Angewandte Chemie International Edition England. 44 (25), 3814-3839 (2005).
- Kumar, S., Liang, F., Lawrence, D., Zhang, Z. Small molecule approach to studying protein tyrosine phosphatase. Methods. 35 (1), 9-21 (2005).
- Tautz, L., Pellecchia, M., Mustelin, T. Targeting the PTPome in human disease. Expert Opinion in Thereapeutics Targets. 10 (1), 157-177 (2006).
- Tautz, L., Mustelin, T. Strategies for developing protein tyrosine phosphatase inhibitors. Methods. 42 (3), 250-260 (2007).
- Vintonyak, V., Antonchick, A., Rauh, D., Waldmann, H. The therapeutic potential of phosphatase inhibitors. Current Opinion in Chemical Biology. 13 (3), 272-283 (2009).
- Barr, A. Protein tyrosine phosphatases as drug targets: strategies and challenges of inhibitor development. Future Medicinal Chemistry. 2 (10), 1563-1576 (2010).
- He, R., Zeng, L., He, Y., Zhang, S., Zhang, Z. Small molecule tools for functional interrogation of protein tyrosine phosphatases. FEBS Journal. 280, 731-750 (2012).
- Tsutsumi, R., Ran, H., Neel, B. G. Off-target inhibition by active site-targeting SHP2 inhibitors. FEBS Open Biology. 8 (9), 1405-1411 (2018).
- Chen, Y. N., et al. Allosteric inhibition of SHP2 phosphatase inhibits cancers driven by receptor tyrosine kinases. Nature. 535 (7610), 148-152 (2016).
- Nichols, R. J., et al. RAS nucleotide cycling underlies the SHP2 phosphatase dependence of mutant BRAF-, NF1- and RAS-driven cancers. Nature Cell Biology. 20 (9), 1064-1073 (2018).
- . Clinical Trial NCT03114319 Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03114319?term=NCT03114319_rank=1 (2019)
- . Clinical Trial NCT03634982 Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03114319?term=NCT03634982_rank=1 (2019)
- Sun, X., et al. Selective inhibition of leukemia-associated SHP2(E69K) mutant by the allosteric SHP2 inhibitor SHP099. Leukemia. 32 (5), 1246-1249 (2018).
- LaRochelle, J. R., et al. Structural reorganization of SHP2 by oncogenic mutations and implications for oncoprotein resistance to allosteric inhibition. Nature Communication. 9 (1), 4508 (2018).
- Padua, R. A. P., et al. Mechanism of activating mutations and allosteric drug inhibition of the phosphatase SHP2. Nature Communication. 9 (1), 4507 (2018).
- Lu, H., et al. Resistance to allosteric SHP2 inhibition in FGFR-driven cancers through rapid feedback activation of FGFR. Oncotarget. 11 (3), 265-281 (2020).
- Smyth, L. A., Collins, I. Measuring and interpreting the selectivity of protein kinase inhibitors. Journal of Chemical Biology. 2 (3), 131-151 (2009).
- Martinez Molina, D., et al. Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay. Science. 341 (6141), 84-87 (2013).
- Ericsson, U., Hallberg, B., Detitta, G., Dekker, N., Nordlund, P. Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies. Analytical Biochemistry. 357 (2), 289-298 (2006).
- McNulty, D. E., et al. A High-Throughput Dose-Response Cellular Thermal Shift Assay for Rapid Screening of Drug Target Engagement in Living Cells, Exemplified Using SMYD3 and IDO1. SLAS Discovery. 23 (1), 34-46 (2018).
- Romero, C., et al. A cellular target engagement assay for the characterization of SHP2 (PTPN11) phosphatase inhibitors. Journal of Biological Chemistry. 295 (9), 2601-2613 (2020).
- Ran, H., Tsutsumi, R., Araki, T., Neel, B. G. Sticking It to Cancer with Molecular Glue for SHP2. Cancer Cell. 30 (2), 194-196 (2016).
