Оценка клеточного целевого взаимодействия с помощью ингибиторов PHP2 (PTPN11) Фосфатазы
Summary
Способность оценивать целевое участие ингибиторов-кандидатов в нетронутых клетках имеет решающее значение для обнаружения наркотиков. Этот протокол описывает 384 хорошо формат клеточного теплового сдвига анализ, который надежно обнаруживает клеточной целевой взаимодействия ингибиторов ориентации либо дикого типа SHP2 или его онкогенных вариантов.
Abstract
Src-гомология 2 (SH2) домен-содержащих фосфатазы 2 (SHP2), закодированный PTPN11 прото-онкоген, является ключевым посредником рецептора тирозин киназы (RTK) управляемых клеточной сигнализации, содействие выживанию клеток и распространения. Кроме того, SHP2 набирается рецепторами иммунной точки проверки для ингибирования активации B и Т-клеток. Аномальные функции SHP2 был вовлечен в развитие, прогрессирование и метастазы многих видов рака. Действительно, небольшие молекулы SHP2 ингибиторы недавно вступили в клинические испытания для лечения твердых опухолей с Ras / Raf / ERK активации пути, в том числе опухолей с некоторыми онкогенных мутаций Рас. Тем не менее, текущий класс ингибиторов SHP2 не эффективен против онкогенных вариантов SHP2, которые часто встречаются при лейкемии, и развитие конкретных малых молекул, нацеленных на онкогенный SHP2, является предметом текущих исследований. Распространенной проблемой большинства кампаний по открытию лекарств с участием цитозоловых белков, таких как SHP2, является то, что первичные анализы, которые управляют химическим открытием, часто являются анализами в пробирке, которые не сообщают о клеточном целевом участии соединений кандидатов. Чтобы обеспечить платформу для измерения активности клеточных целевых, мы разработали как дикий тип, так и мутант SHP2 сотовых тепловых сдвиг анализов. Эти анализы надежно обнаруживают целевое взаимодействие ингибиторов SHP2 в клетках. Здесь мы предоставляем всеобъемлющий протокол этого анализа, который является ценным инструментом для оценки и характеристики ингибиторов SHP2.
Introduction
Тирозин фосфорилирование играет важную роль в трансдукции сигнала вклетках 1,,2. Эта пост-трансляционная модификация катализуется белковых тирозин-киназами (ПТК) и обращена вспять белковых тирозинфосфатов (ПТП). Таким образом, аномальные функции ПТК или ПТП приводит к многим наследственным или приобретенным заболеваниям человека3,,4,,5,,6. Src-гомология 2 (SH2) домен-содержащий фосфатазы 2 (SHP2) является широко выраженным не-рецептор типа PTP кодируется прото-онкоген PTPN117 и является ключевымрегулятором многочисленных физиологических процессов, которые включают трансдукции сигнала путем активации Ras/ Raf/ ERK, PI3K/Akt, или JAK/STATсигнализации пути 8. Как правило, активность SHP2 жестко регулируется для предотвращения аномальной сигнализации. В базальных условиях SHP2 автоматически блокируется своим N-терминалом SH2 домена, который блокирует доступ к активному сайту в области каталитической фосфатазы(рисунок 1A)9,10. После активации клеток, тирозин фосфорилированные связывающие белки набирают SHP2, заставляя его принять его активную конформацию, в которой активный сайт теперь доступен для своих субстратов. Во многих видах рака активность SHP2 повышена. Соматические усиления функции (GOF) мутации в PTPN11 были выявлены в основном при лейкемии и предотвращения связывания N-SH2 домена фосфатазы домена, в результате чего составно активны sHP2 (Рисунок 1B)11. Мутации germline GOF в PTPN11 отвечают за 50% случаев синдрома Нунана, расстройства развития с повышенным риском злокачественности12. В твердых опухолях, где мутации PTPN11 редки, более высокие уровни фосфорилированных связывающих белков приводят к повышенной активности SHP2(рисунок 1C). SHP2 также имеет важное значение для сигнализации иммунной контрольно-пропускной пункт, как контрольно-пропускные рецепторы, такие как BTLA или PD-1 набирать SHP2 для дефосфорилата ключевых сигнальных молекул, предотвращаяактивацию иммунных клеток 13,14,15.
Нацеливание PTPs с небольшими молекулами было проблемой, потому что активное место PTPs высоки сохранено и высоки поручено; ингибиторы, нацеленные на активный участок, часто являются мощными, но обладают плохой избирательностью и устной биодоступностью16,,17,,18,,19,,20,,21,,22. Действительно, многие сообщили SHP2 ингибиторы страдают от плохой избирательности и отсутствие эффективности в клетках23. В последнее время были зарегистрированы алостерические ингибиторы SHP2 с хорошей потенцией и отличной избирательностью (например, SHP09924 и RMC-455025)и вызвали новый интерес к ингибиторам SHP2. Соединения на основе SHP099 и RMC-4550 в настоящее время находятся в фазе I клинических испытаний для лечения твердых опухолей с рецептором тирозинкиназы (RTK)активации пути 26,27. Хотя новаторские, эти соединения являются неэффективными против многих из онкогенных мутантов SHP2, которые управляют лейкемогенезом в значительном числебольных раком крови 28,29,30. Это отсутствие потенции SHP099-как соединения к SHP2 онкогенных вариантов проистекает из их уникального алостерического механизма, так как они подавляют активность SHP2 путем связывания и стабилизации неактивной, закрытой конформации, которая нарушается в SHP2 мутантов. Кроме того, на основенедавнего доклада 31, адаптивной устойчивости механизмов у пациентов, лечения с SHP099-как ингибиторы вполне мыслимы. Следовательно, разработка ингибиторов SHP2 нового поколения, нацеленных на его активное, открытое состояние, является предметом интенсивных исследований.
Характеристика новых ингибиторов SHP2 в клетках является важным аспектом процесса оптимизации свинца. Критически, доказано целевое участие ингибитора в физиологических условиях обеспечивает дополнительный уровень уверенности в том, что ресурсы для лекарственной химии эффективно развернуты на соединениях с перспективной клеточной эффективностью. В прошлом было разработано несколько методов оценки привязки малых ингибиторов молекул к их целям, в первую очередь для белковых киназы32. Для разработки SHP2 клеточной целевой взаимодействия анализа, мы использовали сотовый тепловой сдвиг анализ33. Этот анализ, похожий на термальный сдвиг in vitro (PTS) дляанализа белков 34, отслеживает тепловую стабильность целевого белка, который обычно изменяется связыванием малых молекул. Первоначальный анализ является низкой пропускной способностью анализа, который использует антитела для количественной оценки целевых уровней белка. Кроме того, мы выбрали недавно сообщили вариант теплового сдвига анализ, который использует β-галактозидазы фермента фрагмента дополнения (EFC) анализ (Рисунок 2)35. Для этих экспериментов, белок интереса выражается в клетках как N- или C-терминал синтеза белка проведения расширенной ProLabel теги (ePL, 42 аминокислоты фрагмент β-галактозидазы). Клетки затем передаются в 384-хорошо PCR совместимых пластин и инкубируется с соединениями, представляющими интерес. Термоциклер используется для применения градиента температуры к клеткам, белки которых будут денатурировать и агрегировать по мере повышения температуры в зависимости от их тепловой стабильности. Способность соединения кандидата связывать и стабилизировать белок интереса приведет к повышенной тепловой стабильности этого белка. Таким образом, после лиза клеток, те помеченные белки, которые были стабилизированы соединением кандидата, останутся в растворе при более высоких температурах, чем помеченные белки клеток, инкубированных с контролем транспортного средства. Репортер фермента acceptor (EA) способен дополнить растворимые ePL-тегами белков, в результате чего обнаруживается β-галактозидазы деятельности с помощью люминесценции субстрата.
Недавно мы разработали надежный клеточный тепловой сдвиг анализ для дикого типа SHP2 (SHP2-WT) и частые SHP2 онкогенный вариант (SHP2-E76K) в миниатюрном формате 384-ну36. Здесь мы сообщаем подробный протокол этого анализа, который надежно обнаруживает целевое взаимодействие ингибиторами SHP2 в клетках и демонстрирует высокую степень корреляции между потенцией ингибитора и данными о клеточном тепловом сдвиге. Общий рабочий процесс анализа иллюстрируется на рисунке 3. Наша платформа использует N-терминированно помеченные полнометражные белки синтеза ePL-SHP2. Для генерации соответствующих pICP-ePL-N-SHP2-WT и pICP-ePL-N-SHP2-E76K выражения плазмидов, пожалуйста, обратитесь к нашей недавней публикации36. Этот анализ может быть выполнен с использованием теплового градиента для создания тепловых профилей SHP2 и определения температуры плавления SHP2 при наличии или отсутствии ингибитора. После того, как тепловые профили были установлены, он также может быть выполнен в изотермальных условиях, что позволяет ингибитор доза-ответ оценки. Оба типа экспериментов описаны ниже.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы представили анализ целевого взаимодействия, который может подтвердить прямую привязку малых молекул к фосфатазе SHP2 в клетках. Анализ может различать ингибиторы низкого и высокого сродства и, что важно, подтвердить отсутствие потенции со стороны алостерических ингибиторов типа SHP099…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения Грант 1R21CA195422 (К Л. Т.), Эпштейн Семьи Фонд премии (N. D. P.C.), и NCI онкологический центр Поддержка Грант P30CA030199. Кроме того, этот проект финансировался в целом или частично за счет федеральных средств Национального института рака, Национальных институтов здравоохранения, в соответствии с контрактом Консорциума химической биологии No. HHSN261200800001E. Содержание этой публикации не обязательно отражает мнения или политику Министерства здравоохранения и социальных служб, равно как и не упоминает торговые названия, коммерческие продукты или организации, подразумевающие одобрение правительством США. Содержание является исключительно ответственностью авторов и не обязательно отражает официальные взгляды Национальных институтов здравоохранения.
Materials
| 384-well gradient equipped thermocycler | Eppendorf AG | X50h | |
| 384-well low dead volume microplate Echo qualified | Beckman Coulter, Inc. | LP-0200 | |
| 6-well cell culture plates | Greiner Bio-One | 657 160 | Sterile with lid |
| Antibiotic-Antimycotic (Anti Anti) 100 X | Thermo Fisher Scientific | 15240-062 | |
| Cell counter | Thermo Fisher Scientific | Countess II FL | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium 1X + GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 10566-016 | 500 mL |
| Echo acoustic liquid handler | Beckman Coulter, Inc. | Echo 550 | |
| Electronic multichannel pipette | Thermo Fisher Scientific | E1 ClipTip | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 26140-079 | 500 mL |
| HEPES buffer | Thermo Fisher Scientific | 15630-680 | 100 mL |
| InCell Pulse starter kit | Eurofins DiscoverX Corp. | 94-4007 | Components include EA buffer, lysis buffer, and substrate |
| Microplate reader | Tecan Trading AG | Spark | |
| Single channel solution trough | Thermo Fisher Scientific | S253012005 | |
| Sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360-010 | 100 mM |
| Thermal microplate sealer | Agilent Technologies, Inc. | PlateLoc | |
| Transfection reagents | Polyplus Transfection | jetPRIME | |
| Trypan blue | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| TrypLE Express reagent | Thermo Fisher Scientific | 12605-010 | |
| Twin.tec 384 real-time PCR plates | Eppendorf AG | 30132734 |
References
- Hunter, T. Tyrosine phosphorylation: thirty years and counting. Current Opinion in Cell Biology. 21 (2), 140-146 (2009).
- Alonso, A., et al. Protein tyrosine phosphatases in the human genome. Cell. 117 (6), 699-711 (2004).
- Cohen, P. Protein kinases-the major drug targets of the twenty-first century. Nature Reviews Drug Discovery. 1 (4), 309 (2002).
- Ferguson, F. M., Gray, N. S. Kinase inhibitors: the road ahead. Nature Reviews: Drug Discovery. 17 (5), 353-377 (2018).
- Stanford, S. M., Bottini, N. Targeting Tyrosine Phosphatases: Time to End the Stigma. Trends in Pharmacological Sciences. 38 (6), 524-540 (2017).
- Tonks, N. Protein tyrosine phosphatases–from housekeeping enzymes to master regulators of signal transduction. FEBS Journal. 280 (2), 346-378 (2013).
- Chan, R., Feng, G. PTPN11 is the first identified proto-oncogene that encodes a tyrosine phosphatase. Blood. 109 (3), 862-867 (2007).
- Chan, G., Kalaitzidis, D., Neel, B. The tyrosine phosphatase Shp2 (PTPN11) in cancer. Cancer Metastasis Rev. 27 (2), 179-192 (2008).
- Hof, P., Pluskey, S., Dhe-Paganon, S., Eck, M., Shoelson, S. Crystal structure of the tyrosine phosphatase SHP-2. Cell. 92 (4), 441-450 (1998).
- Barford, D., Neel, B. Revealing mechanisms for SH2 domain mediated regulation of the protein tyrosine phosphatase SHP-2. Structure. 6 (3), 249-254 (1998).
- Neel, B. G., Chan, G., Dhanji, S. . Handbook of Cell Signaling (Second Edition). 2, 771-809 (2010).
- Tartaglia, M., et al. Mutations in PTPN11, encoding the protein tyrosine phosphatase SHP-2, cause Noonan syndrome. Nature Genetics. 29 (4), 465-468 (2001).
- Yokosuka, T., et al. Programmed cell death 1 forms negative costimulatory microclusters that directly inhibit T cell receptor signaling by recruiting phosphatase SHP2. Journal of Experimental Medicine. 209 (6), 1201-1217 (2012).
- Okazaki, T., Maeda, A., Nishimura, H., Kurosaki, T., Honjo, T. PD-1 immunoreceptor inhibits B cell receptor-mediated signaling by recruiting src homology 2-domain-containing tyrosine phosphatase 2 to phosphotyrosine. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (24), 13866-13871 (2001).
- Watanabe, N., et al. BTLA is a lymphocyte inhibitory receptor with similarities to CTLA-4 and PD-1. Nature Immunology. 4 (7), 670-679 (2003).
- Bialy, L., Waldmann, H. Inhibitors of protein tyrosine phosphatases: next-generation drugs. Angewandte Chemie International Edition England. 44 (25), 3814-3839 (2005).
- Kumar, S., Liang, F., Lawrence, D., Zhang, Z. Small molecule approach to studying protein tyrosine phosphatase. Methods. 35 (1), 9-21 (2005).
- Tautz, L., Pellecchia, M., Mustelin, T. Targeting the PTPome in human disease. Expert Opinion in Thereapeutics Targets. 10 (1), 157-177 (2006).
- Tautz, L., Mustelin, T. Strategies for developing protein tyrosine phosphatase inhibitors. Methods. 42 (3), 250-260 (2007).
- Vintonyak, V., Antonchick, A., Rauh, D., Waldmann, H. The therapeutic potential of phosphatase inhibitors. Current Opinion in Chemical Biology. 13 (3), 272-283 (2009).
- Barr, A. Protein tyrosine phosphatases as drug targets: strategies and challenges of inhibitor development. Future Medicinal Chemistry. 2 (10), 1563-1576 (2010).
- He, R., Zeng, L., He, Y., Zhang, S., Zhang, Z. Small molecule tools for functional interrogation of protein tyrosine phosphatases. FEBS Journal. 280, 731-750 (2012).
- Tsutsumi, R., Ran, H., Neel, B. G. Off-target inhibition by active site-targeting SHP2 inhibitors. FEBS Open Biology. 8 (9), 1405-1411 (2018).
- Chen, Y. N., et al. Allosteric inhibition of SHP2 phosphatase inhibits cancers driven by receptor tyrosine kinases. Nature. 535 (7610), 148-152 (2016).
- Nichols, R. J., et al. RAS nucleotide cycling underlies the SHP2 phosphatase dependence of mutant BRAF-, NF1- and RAS-driven cancers. Nature Cell Biology. 20 (9), 1064-1073 (2018).
- . Clinical Trial NCT03114319 Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03114319?term=NCT03114319_rank=1 (2019)
- . Clinical Trial NCT03634982 Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03114319?term=NCT03634982_rank=1 (2019)
- Sun, X., et al. Selective inhibition of leukemia-associated SHP2(E69K) mutant by the allosteric SHP2 inhibitor SHP099. Leukemia. 32 (5), 1246-1249 (2018).
- LaRochelle, J. R., et al. Structural reorganization of SHP2 by oncogenic mutations and implications for oncoprotein resistance to allosteric inhibition. Nature Communication. 9 (1), 4508 (2018).
- Padua, R. A. P., et al. Mechanism of activating mutations and allosteric drug inhibition of the phosphatase SHP2. Nature Communication. 9 (1), 4507 (2018).
- Lu, H., et al. Resistance to allosteric SHP2 inhibition in FGFR-driven cancers through rapid feedback activation of FGFR. Oncotarget. 11 (3), 265-281 (2020).
- Smyth, L. A., Collins, I. Measuring and interpreting the selectivity of protein kinase inhibitors. Journal of Chemical Biology. 2 (3), 131-151 (2009).
- Martinez Molina, D., et al. Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay. Science. 341 (6141), 84-87 (2013).
- Ericsson, U., Hallberg, B., Detitta, G., Dekker, N., Nordlund, P. Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies. Analytical Biochemistry. 357 (2), 289-298 (2006).
- McNulty, D. E., et al. A High-Throughput Dose-Response Cellular Thermal Shift Assay for Rapid Screening of Drug Target Engagement in Living Cells, Exemplified Using SMYD3 and IDO1. SLAS Discovery. 23 (1), 34-46 (2018).
- Romero, C., et al. A cellular target engagement assay for the characterization of SHP2 (PTPN11) phosphatase inhibitors. Journal of Biological Chemistry. 295 (9), 2601-2613 (2020).
- Ran, H., Tsutsumi, R., Araki, T., Neel, B. G. Sticking It to Cancer with Molecular Glue for SHP2. Cancer Cell. 30 (2), 194-196 (2016).
