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Biology

마우스로부터 단리되고 배양된 성숙한 골격근에서의 인슐린- 및 수축-자극된 글루코스 흡수의 측정

Published: May 16, 2021
doi:
10.3791/61398
, , , , , ,
1Section of Molecular Physiology, Department of Nutrition, Exercise and Sports,University of Copenhagen, 2Section of Integrative Physiology, Department of Nutrition, Exercise and Sports,University of Copenhagen

Summary

근육 포도당 흡수의 온전한 조절은 전신 포도당 항상성을 유지하는 데 중요합니다. 이 프로토콜은 전신 포도당 대사에 대한 다양한 생리적 개입의 영향을 묘사 할 때 단리되고 배양 된 성숙한 골격근에서 인슐린 및 수축 자극 포도당 흡수에 대한 평가를 제시합니다.

Abstract

골격근은 인슐린 반응 조직이며 일반적으로 식사 후 혈액으로 들어가는 포도당의 대부분을 차지합니다. 또한, 골격근은 휴식 조건에 비해 운동 중에 혈액에서 포도당의 추출을 최대 50 배까지 증가시킬 수 있다고보고되었습니다. 운동 및 인슐린 자극 동안 근육 포도당 흡수의 증가는 글루코스 수송체 4 (GLUT4)의 세포 내 구획에서 근육 세포 표면 막으로의 전좌뿐만 아니라 헥소키나제 II에 의한 글루코스-6-포스페이트로의 글루코스의 인산화에 의존한다. m. soleus 및 m . extensor digitorum longus (EDL)와 같은 마우스 근육의 분리 및 인큐베이션은 성숙한 골격근의 포도당 흡수에 대한 인슐린 및 전기적으로 유도 된 수축 (운동을위한 모델)의 효과를 연구하기에 적절한 생체 외 모델입니다. 따라서, 생체외 모델은 근육 인슐린 감수성의 평가를 허용하고, 수축 동안 근육력 생산을 일치시켜 근육 글루코스 흡수의 측정 동안 근섬유의 균일한 모집을 보장하는 것을 가능하게 한다. 더욱이, 기술된 모델은 근육 인슐린 감수성에 영향을 미칠 수 있거나 골격근 글루코스 흡수의 조절 복잡성을 묘사하려고 할 때 도움이 될 수 있는 약리학적 화합물 시험에 적합하다.

여기서 우리는 방사성표지된 [3H]2-데옥시-D-글루코오스 및 [14C]만니톨을 세포외 마커로서 사용하여 마우스로부터 단리되고 배양된 단독 및 EDL 근육 제제에서 인슐린 및 수축-자극된 글루코스 흡수를 측정하는 방법에 대한 상세한 프로토콜을 설명하고 제공한다. 이것은 온전한 동물 모델에서 방해 할 수있는 혼란스러운 요인이없는 성숙한 골격근에서의 포도당 흡수의 정확한 평가를 가능하게합니다. 또한, 우리는 인큐베이션 마우스 골격근의 대사 생존력에 대한 정보를 제공하여 적용된 방법이 근육 에너지 대사를 연구 할 때 특정 조건 하에서주의 사항을 가지고 있음을 시사합니다.

Introduction

골격근은 인슐린과 운동에 반응하여 세포 외 공간에서 다량의 포도당을 추출 할 수있는 능력을 가지고 있습니다. 이것은 전신 포도당 항상성을 유지하는 데 도움이되며 높은 에너지 수요의시기에 포도당 공급을 확보합니다. 골격근 글루코스 흡수의 온전한 조절이 전반적인 건강 및 신체 성능(1,2)에 중요한 것으로 밝혀졌기 때문에, 다양한 조건 동안 근육 글루코스 흡수의 측정은 많은 주목을 받고 있다. 인간 및 동물에서, 고인슐린성-유혈당 클램프는 생체내 인슐린 민감성을 평가하기 위한 황금 표준 기술로서 3,4 이용되어 왔다. 경구 포도당 내성 검사에서 얻은 결과와는 달리, 고인슐린성 유글리세믹 클램프 기술은 췌장으로부터의 온전한 위장 기능 또는 인슐린 분비를 요구하지 않으며, 따라서 인슐린 반응이 위장 장 및/또는 췌장 기능의 변화를 나타내는 피험자들 사이에서 비교될 수 있게 한다. 인간의 운동 중 생체 내 근육 포도당 흡수의 측정은 1960 년대5 이후 자주 수행되었습니다. 먼저 동맥 균형 기술(6)의 사용에 의해 그리고 나중에 양전자 방출 단층촬영(PET) 이미징을 사용하여 양전자 방출 글루코스 유사체 예컨대 18F-플루오로데옥시글루코스7을 방출한다. 설치류에서, 생체 내에서 운동-자극된 근육 글루코스 흡수는 전형적으로 방사성 또는 안정한 동위원소-표지된 글루코스 유사체 8,9,10의 사용에 의해 수행된다.

생체 내에서 근육 글루코스 흡수를 측정하기 위한 상보적인 방법은 설치류로부터 작은 근육을 분리 및 배양하고, 이어서 방사성 또는 안정한 동위원소 표지된 글루코스 유사체11,12,13을 사용하여 글루코스 흡수를 측정하는 것이다. 이 방법은 성숙한 골격근에서 포도당 흡수율의 정확하고 신뢰할 수있는 정량화를 허용하며 다양한 인슐린 농도의 존재 및 전기 자극에 의해 유발 된 수축 중에 수행 될 수 있습니다. 더 중요한 것은, 격리되고 배양된 골격근에서의 글루코스 흡수의 측정은 다양한 개입(예를 들어, 영양, 신체 활동, 감염, 치료제)을 겪은 마우스의 근육 대사 표현형을 조사할 때 관련성이 있다. 분리된 골격근 모델은 또한 글루코스 흡수에 영향을 미치거나 인슐린 감수성(12,14)을 변형시킬 수 있는 약리학적 화합물 검사에 적합한 도구이다. 이러한 방식으로, 근육 글루코스 대사를 조절하도록 설계된 화합물의 효능은 전임상 동물 모델에서 후속 생체내 시험 전에 고도로 조절된 환경에서 시험되고 평가될 수 있다.

일부 조건하에서, 대사 생존력은 단리되고 인큐베이션된 골격근 모델 시스템에서 도전을 제기할 수 있다. 실제로, 인큐베이션 된 근육에서 순환계의 부족은 기질 (예 : 산소 및 영양소)의 전달이 근육 섬유와 주변 환경 사이의 단순한 확산에 완전히 의존한다는 것을 수반합니다. 이와 관련하여, 인큐베이션된 근육이 작고 얇고, 따라서, 인큐베이션(15) 동안 산소 확산에 대한 장벽을 덜 나타내는 것이 중요하다. 특히 몇 시간 동안 장기간 배양하는 동안, 저산소 상태는 불충분 한 산소 공급으로 인해 근육 에너지 고갈을 초래할 수 있습니다(15). 인큐베이션된 래트 근육에서의 대사 생존력의 다양한 마커가 래트 근육 생존력을 유지하는 데 도움이 되는 중요한 변수의 확인과 함께 이전에 보고되었지만(15), 작은 인큐베이션된 마우스 근육에서의 대사 생존력에 대한 포괄적인 평가는 여전히 보증된다. 따라서, 현재, 글리코겐 함량은 주로 배양된 마우스 골격근16,17에서 대사 생존력의 마커로서 사용되어 왔다.

여기서 우리는 방사성표지된 [3H]2-데옥시-D-글루코스 및 [14C]만니톨을 세포외 마커로서 사용하여 마우스로부터 단리되고 배양된 단독 및 EDL 근육에서 기저, 인슐린- 및 수축-자극된 글루코스 흡수를 측정하기 위한 상세한 프로토콜을 기술한다. 본 연구에서, 글루코스 흡수는 10분 기간 동안 측정되었고, 이 방법은 단일 수축 프로토콜뿐만 아니라 서브 최대화 및 최대 효과적인 인슐린 농도의 사용과 함께 제시된다. 그러나, 본원에 기재된 프로토콜은 인큐베이션 시간, 인슐린-투여량, 및 전기 자극 프로토콜과 관련하여 용이하게 변형될 수 있다. 또한, 우리는 인큐베이션된 발바닥 및 EDL 마우스 근육에서 대사 생존력의 다양한 마커의 철저한 특성화를 제공한다. 결과는 인큐베이션 버퍼에 글루코스 보충이 1시간 동안 인큐베이션된 근육의 대사 생존력을 보존하는데 필수적이라는 것을 나타낸다.

Protocol

연구 동물과 관련된 절차는 관련 지침 및 현지 법률에 따라 수행되어야합니다. 이 연구에 사용 된 모든 동물 실험은 실험 및 기타 과학적 목적으로 사용되는 척추 동물 보호를위한 유럽 협약을 준수했으며 덴마크 동물 실험 검사원의 승인을 받았습니다. 1. 실험 장치 및 봉합사 루프의 제조 참고: 이 연구에서는 맞춤형 인큐베이션 후크가 있는 통합 근육 스?…

Representative Results

도 2에 나타난 바와 같이 기저 글루코스 흡수율은 암컷 마우스로부터 분리된 단독과 EDL 근육 사이에서 유사하였다. 이것은 또한12,13,19,20 이전에 여러 번보고되었습니다. 포도당 흡수는 최하위 유효 인슐린 농도 (100 μU / mL)에 반응하여 단독 및 EDL 근육에?…

Discussion

골격근에서 포도당 흡수의 온전한 조절은 전반적인 건강을 보존하는 데 중요합니다1. 따라서 근육 포도당 섭취에 대한 조사는 종종 다양한 건강 변화 개입을 평가할 때 일차 판독 수단으로 작용합니다. 여기에서는 인슐린 및 전기적으로 유도된 수축에 반응하여 마우스로부터 단리되고 배양된 단독 및 EDL 근육에서의 글루코스 흡수를 측정하기 위한 생체외 방법을 기술한다. 이 ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 연구는 덴마크 독립 연구 협의회 (FSS8020-00288B)와 노보 노디스크 재단 (NNF160C0023046)의 보조금으로 지원되었습니다. 이 연구는 또한 덴마크 당뇨병 아카데미의 Rasmus Kjøbsted에 대한 연구 보조금에 의해 지원되었으며, Novo Nordisk Foundation, 보조금 번호 NNF17SA0031406이 자금을 지원합니다. 저자는 Karina Olsen, Betina Bolmgren, Irene Bech Nielsen (영양학과, 운동 및 스포츠학과, 과학 학부, 코펜하겐 대학)에게 숙련 된 기술 지원에 감사드립니다.

Materials

[14C]D-mannitol American Radiolabeled Chemicals, Inc. ARC 0127
[3H]2-deoxy-D-glucose  American Radiolabeled Chemicals, Inc. ART 0103A
2-Deoxy-D-glucose Sigma D8375
4-0 USP non-sterile surgical nylon suture Harvard Apparatus 51-7698
Streptavidin/HRP (Conjugate) DAKO P0397 Used to detect ACC protein
Akt2 antibody Cell Signaling 3063
AMPKα2 antibody Santa Cruz SC-19131
aprotinin Sigma A1153
benzamidine Sigma B6505
Bovine serum albumin (BSA) Sigma A7030
CaCl2 Merck 1020831000
Calibration kit (force) Danish Myo Technology A/S 300041
Chemiluminescence Millipore WBLUF0500
D-Glucose Merck 1084180100
D-Mannitol Sigma M4125
Data collection program National Instruments LabVIEW software version 7.1
Dialysis tubing Visking DTV.12000.09 Size No.9
Digital imaging system BioRad ChemiDoc MP
EDTA Sigma EDS E9884
EGTA Sigma E4378
Electrical Pulse Stimulator Digitimer D330 MultiStim System
Glycerol Sigma G7757
HEPES Sigma H7637
IGEPAL CA-630  Sigma I8896
Insulin Novo Nordisk Actrapid, 100 IE/mL
KCl Merck 1049361000
KH2PO4 Merck 104873025
leupeptin Sigma L2884
MgSO4 Merck 1058860500
Muscle Strip Myograph System Danish Myo Technology A/S Model 820MS
Na-Orthovanadate Sigma S6508
Na-Pyrophosphate Sigma 221368
Na-Pyruvate Sigma P2256
NaCl Merck 106041000
NaF Sigma S1504
NaHCO3 VWR 27778260
pACC Ser212 antibody Cell Signaling 3661
pAkt Thr308 antibody Cell Signaling 9275
pAMPK Thr172 antibody Cell Signaling 2531
phenylmethylsulfonylfluoride Sigma P7626
Platinum electrodes Danish Myo Technology A/S 300145
pTBC1D4 Ser588 antibody Cell Signaling 8730
Scintillation counter Perkin Elmer Tri-Carb-2910TR
Scintillation fluid  Perkin Elmer 6013329
Statistical analyses software Systat SigmaPlot version 14
TBC1D4 antibody Abcam ab189890
TissueLyser II  Qiagen 85300
Ultrapure water Merck Milli-Q Reference A+ System
β-glycerophosphate Sigma G9422
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References

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Kjøbsted, R., Kido, K., Larsen, J. K., Jørgensen, N. O., Birk, J. B., Hellsten, Y., Wojtaszewski, J. F. P. Measurement of Insulin- and Contraction-Stimulated Glucose Uptake in Isolated and Incubated Mature Skeletal Muscle from Mice. J. Vis. Exp. (171), e61398, doi:10.3791/61398 (2021).
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