מדידת ספיגת גלוקוז מגורה באינסולין ובהתכווצות בשרירי שלד בוגרים מבודדים ומדגרים מעכברים
Summary
ויסות שלם של ספיגת גלוקוז בשרירים חשוב לשמירה על הומאוסטזיס של גלוקוז בכל הגוף. פרוטוקול זה מציג הערכה של ספיגת גלוקוז מגורה באינסולין ובהתכווצות בשרירי שלד בוגרים מבודדים ודגירה כאשר הם מתארים את ההשפעה של התערבויות פיזיולוגיות שונות על חילוף החומרים של גלוקוז בכל הגוף.
Abstract
שרירי השלד הם רקמה המגיבה לאינסולין ובדרך כלל תופסים את רוב הגלוקוז שנכנס לדם לאחר הארוחה. יתר על כן, דווח כי שרירי השלד עשויים להגביר את מיצוי הגלוקוז מהדם עד פי 50 במהלך פעילות גופנית בהשוואה לתנאי מנוחה. העלייה בספיגת הגלוקוז בשרירים במהלך פעילות גופנית וגירוי אינסולין תלויה בטרנסלוקציה של טרנספורטר גלוקוז 4 (GLUT4) מתאים תוך תאיים לקרום פני השטח של תאי השריר, כמו גם זרחון של גלוקוז לגלוקוז-6-פוספט על ידי הקסוקינאז II. בידוד ודגירה של שרירי עכבר כגון m. soleus ו- m. extensor digitorum longus (EDL) הוא מודל ex vivo מתאים לחקר ההשפעות של אינסולין והתכווצות חשמלית המושרה (מודל לפעילות גופנית) על ספיגת גלוקוז בשרירי השלד הבוגרים. לפיכך, מודל ה- ex vivo מאפשר הערכה של רגישות לאינסולין בשרירים ומאפשר להתאים את ייצור כוח השריר במהלך ההתכווצות ומבטיח גיוס אחיד של סיבי שריר במהלך מדידות של ספיגת גלוקוז בשרירים. יתר על כן, המודל המתואר מתאים לבדיקת תרכובות פרמקולוגיות שעשויות להשפיע על הרגישות לאינסולין בשרירים או עשויות להועיל כאשר מנסים להגדיר את המורכבות הרגולטורית של ספיגת גלוקוז בשריר השלד.
כאן אנו מתארים ומספקים פרוטוקול מפורט כיצד למדוד ספיגת גלוקוז מגורה של אינסולין והתכווצות בסולאוס מבודד ודגירה ותכשירי שרירי EDL מעכברים באמצעות רדיו-תווית [3H]2-deoxy-D-glucose ו-[14C] מניטול כסמן חוץ-תאי. זה מאפשר הערכה מדויקת של ספיגת גלוקוז בשרירי השלד הבוגרים בהיעדר גורמים מבלבלים שעלולים להפריע למודל החייתי השלם. בנוסף, אנו מספקים מידע על הכדאיות המטבולית של שרירי שלד עכברים מדוגרים, מה שמרמז על כך שהשיטה המיושמת כוללת כמה אזהרות בתנאים מסוימים בעת לימוד חילוף החומרים של אנרגיית השרירים.
Introduction
שרירי השלד הם בעלי יכולת לחלץ כמויות גדולות של גלוקוז מהחלל החוץ-תאי בתגובה לאינסולין ולפעילות גופנית. זה עוזר לשמור על הומאוסטזיס של גלוקוז בכל הגוף ומבטיח אספקת גלוקוז בזמנים של ביקוש גבוה לאנרגיה. מאחר שהוכח כי ויסות שלם של ספיגת הגלוקוז בשרירי השלד חשוב לבריאות הכללית ולביצועים הגופניים 1,2, מדידות של ספיגת גלוקוז בשרירים במהלך מצבים שונים זכו לתשומת לב רבה. בבני אדם ובבעלי חיים, המהדק ההיפר-אינסולינמי-אוגליקמי שימש כטכניקת תקן הזהב להערכת הרגישות לאינסולין in vivo 3,4. בניגוד לממצאים שהתקבלו מבדיקת סבילות לגלוקוז דרך הפה, טכניקת המהדק ההיפר-אינסולינמי-יוגליקמי אינה דורשת תפקוד שלם של מערכת העיכול או הפרשת אינסולין מהלבלב ובכך מאפשרת להשוות את תגובות האינסולין בין נבדקים המפגינים שינויים בתפקוד מערכת העיכול ו/או הלבלב. מדידות של ספיגת גלוקוז בשרירים in vivo במהלך פעילות גופנית בבני אדם בוצעו לעתים קרובות מאז שנות ה-60של המאה ה-20 5. תחילה על ידי שימוש בטכניקות איזון עורקים6 ומאוחר יותר על ידי שימוש בהדמיית טומוגרפיה של פליטת פוזיטרונים (PET) בשילוב עם אנלוגי פולט גלוקוז פולט פוזיטרון, למשל 18F-Fluoro-deoxy-glucose7. במכרסמים, ספיגת גלוקוז בשריר מגורה פעילות גופנית in vivo מבוצעת בדרך כלל על ידי שימוש באנלוגי גלוקוז רדיואקטיביים או יציבים המסומנים באיזוטופים 8,9,10.
שיטה משלימה למדידות של ספיגת גלוקוז בשרירים in vivo, היא לבודד ולדגום שרירים קטנים ממכרסמים ולאחר מכן למדוד את ספיגת הגלוקוז באמצעות אנלוגים רדיואקטיביים או יציבים בעלי תווית איזוטופית של גלוקוז 11,12,13. שיטה זו מאפשרת כימות מדויק ואמין של שיעורי ספיגת הגלוקוז בשרירי השלד הבוגרים וניתן לבצע אותה בנוכחות ריכוזי אינסולין שונים ובמהלך ההתכווצות המתעוררת על ידי גירוי חשמלי. חשוב מכך, מדידות של ספיגת גלוקוז בשרירי שלד מבודדים ודגירה הן רלוונטיות כאשר חוקרים את הפנוטיפ המטבולי של השריר של עכברים שעברו התערבויות שונות (למשל תזונה, פעילות גופנית, זיהום, טיפולים). מודל שרירי השלד המבודדים הוא גם כלי מתאים לבדיקת תרכובות פרמקולוגיות שעשויות להשפיע על ספיגת הגלוקוז כשלעצמה ו/או לשנות את הרגישות לאינסולין 12,14. בדרך זו, ניתן לבחון ולהעריך את היעילות של תרכובות שנועדו לווסת את חילוף החומרים של הגלוקוז בשרירים בסביבה מבוקרת מאוד לפני ניסויי in vivo הבאים במודלים פרה-קליניים של בעלי חיים.
בתנאים מסוימים, כדאיות מטבולית עשויה להוות אתגר במערכת מודל שרירי השלד המבודדת והדגירה. ואכן, היעדר מערכת הדם בשרירים המדגרים כרוך בכך שאספקת מצעים (למשל חמצן וחומרים מזינים) תלויה באופן מלא בדיפוזיה פשוטה בין סיבי השריר לסביבה. בהקשר זה, יש חשיבות לכך שהשרירים הדגירה הם קטנים ודקים ולכן, מהווים פחות מחסום לפיזור חמצן במהלך הדגירה15. במיוחד במהלך דגירה ממושכת במשך מספר שעות, מצבים היפוקסיים עלולים להתפתח עקב אספקת חמצן לא מספקת וכתוצאה מכך דלדול אנרגיית השרירים15. למרות שסמנים שונים של כדאיות מטבולית בשרירי חולדה דגירה דווחו בעבר לצד זיהוי משתנים חשובים המסייעים בשמירה על כדאיות שרירי החולדה15, הערכה מקיפה של הכדאיות המטבולית בשרירי עכברים דגירה קטנים עדיין מוצדקת. לפיכך, כיום, תכולת הגליקוגן שימשה בעיקר כסמן של כדאיות מטבולית בשרירי שלד עכבר דגירה16,17.
כאן אנו מתארים פרוטוקול מפורט למדידת ספיגת גלוקוז מגורה בזאלי, אינסולין והתכווצות בסולאוס מבודד ומדגר ושרירי EDL מעכברים באמצעות סימון רדיו-תאי [3H]2-דאוקסי-D-גלוקוז ומניטול [14C] כסמן חוץ-תאי. במחקר הנוכחי, ספיגת הגלוקוז נמדדה בפרק זמן של 10 דקות והשיטה מוצגת עם שימוש בריכוזי אינסולין תת-מקסימליים ויעילים ביותר, כמו גם פרוטוקול התכווצות יחיד. עם זאת, ניתן לשנות בקלות את הפרוטוקולים המתוארים כאן ביחס לזמן הדגירה, מינון האינסולין ופרוטוקול הגירוי החשמלי. יתר על כן, אנו מספקים אפיון יסודי של סמנים שונים של כדאיות מטבולית בסולאוס דגירה ושריר עכבר EDL. התוצאות מצביעות על כך שתוספת גלוקוז למאגר הדגירה חיונית כדי לשמור על הכדאיות המטבולית של השריר המדגר במשך שעה.
Protocol
Representative Results
Discussion
ויסות שלם של ספיגת הגלוקוז בשרירי השלד חשוב לשמירה על הבריאות הכללית1. לפיכך, חקר ספיגת הגלוקוז בשרירים משמש לעתים קרובות כקריאה ראשונית בעת הערכת התערבויות שונות המשנות את הבריאות. כאן אנו מתארים שיטת ex vivo למדידת ספיגת גלוקוז בסולאוס מבודד ודגירה ושרירי EDL מעכברים בתגובה לאי…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמועצה הדנית למחקר עצמאי – מדעי הרפואה (FSS8020-00288B) ומקרן נובו נורדיסק (NNF160C0023046). עבודה זו נתמכה גם על ידי מענק מחקר לרסמוס Kjøbsted מהאקדמיה הדנית לסוכרת, הממומנת על ידי קרן נובו נורדיסק, מענק מספר NNF17SA0031406. המחברים רוצים להודות לקרינה אולסן, בטינה בולמגרן ואיירין בק נילסן (המחלקה לתזונה, התעמלות וספורט, הפקולטה למדעים, אוניברסיטת קופנהגן) על הסיוע הטכני המיומן שלהן.
Materials
| [14C]D-mannitol | American Radiolabeled Chemicals, Inc. | ARC 0127 | |
| [3H]2-deoxy-D-glucose | American Radiolabeled Chemicals, Inc. | ART 0103A | |
| 2-Deoxy-D-glucose | Sigma | D8375 | |
| 4-0 USP non-sterile surgical nylon suture | Harvard Apparatus | 51-7698 | |
| Streptavidin/HRP (Conjugate) | DAKO | P0397 | Used to detect ACC protein |
| Akt2 antibody | Cell Signaling | 3063 | |
| AMPKα2 antibody | Santa Cruz | SC-19131 | |
| aprotinin | Sigma | A1153 | |
| benzamidine | Sigma | B6505 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7030 | |
| CaCl2 | Merck | 1020831000 | |
| Calibration kit (force) | Danish Myo Technology A/S | 300041 | |
| Chemiluminescence | Millipore | WBLUF0500 | |
| D-Glucose | Merck | 1084180100 | |
| D-Mannitol | Sigma | M4125 | |
| Data collection program | National Instruments | LabVIEW software version 7.1 | |
| Dialysis tubing | Visking | DTV.12000.09 Size No.9 | |
| Digital imaging system | BioRad | ChemiDoc MP | |
| EDTA | Sigma EDS | E9884 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| Electrical Pulse Stimulator | Digitimer | D330 MultiStim System | |
| Glycerol | Sigma | G7757 | |
| HEPES | Sigma | H7637 | |
| IGEPAL CA-630 | Sigma | I8896 | |
| Insulin | Novo Nordisk | Actrapid, 100 IE/mL | |
| KCl | Merck | 1049361000 | |
| KH2PO4 | Merck | 104873025 | |
| leupeptin | Sigma | L2884 | |
| MgSO4 | Merck | 1058860500 | |
| Muscle Strip Myograph System | Danish Myo Technology A/S | Model 820MS | |
| Na-Orthovanadate | Sigma | S6508 | |
| Na-Pyrophosphate | Sigma | 221368 | |
| Na-Pyruvate | Sigma | P2256 | |
| NaCl | Merck | 106041000 | |
| NaF | Sigma | S1504 | |
| NaHCO3 | VWR | 27778260 | |
| pACC Ser212 antibody | Cell Signaling | 3661 | |
| pAkt Thr308 antibody | Cell Signaling | 9275 | |
| pAMPK Thr172 antibody | Cell Signaling | 2531 | |
| phenylmethylsulfonylfluoride | Sigma | P7626 | |
| Platinum electrodes | Danish Myo Technology A/S | 300145 | |
| pTBC1D4 Ser588 antibody | Cell Signaling | 8730 | |
| Scintillation counter | Perkin Elmer | Tri-Carb-2910TR | |
| Scintillation fluid | Perkin Elmer | 6013329 | |
| Statistical analyses software | Systat | SigmaPlot version 14 | |
| TBC1D4 antibody | Abcam | ab189890 | |
| TissueLyser II | Qiagen | 85300 | |
| Ultrapure water | Merck | Milli-Q Reference A+ System | |
| β-glycerophosphate | Sigma | G9422 |
References
- DeFronzo, R., Tripathy, D. Skeletal muscle insulin resistance is the primary defect in type 2 diabetes. Diabetes Care. 32, 157-163 (2009).
- Coyle, E. F., et al. Carbohydrate feeding during prolonged strenuous exercise can delay fatigue. Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 55 (1), 230-235 (1983).
- Kim, J. K. Hyperinsulinemic-euglycemic clamp to assess insulin sensitivity in vivo. Methods in Molecular Biology. 560, 221-238 (2009).
- Ayala, J. E., Bracy, D. P., McGuinness, O. P., Wasserman, D. H. Considerations in the design of hyperinsulinemic-euglycemic clamps in the conscious mouse. Diabetes. 55 (2), 390-397 (2006).
- Richter, E. A., Hargreaves, M. Exercise, GLUT4, and skeletal muscle glucose uptake. Physiological Reviews. 93 (3), 993-1017 (2013).
- Sanders, C. A., Levinson, G. E., Abelmann, W. H., Freinkel, N. Effect of exercise on the peripheral utilization of glucose in man. The New England Journal of Medicine. 271, 220-225 (1964).
- Barrington, S. F., Maisey, M. N. Skeletal muscle uptake of fluorine-18-FDG: effect of oral diazepam. Journal of Nuclear Medicine Official Publication, Society of Nuclear Medicine. 37 (7), 1127-1129 (1996).
- Fentz, J., et al. AMPKα is critical for enhancing skeletal muscle fatty acid utilization during in vivo exercise in mice. FASEB Journal. 29 (5), 1725-1738 (2015).
- Maarbjerg, S. J., et al. Genetic impairment of AMPKalpha2 signaling does not reduce muscle glucose uptake during treadmill exercise in mice. American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 297 (4), 924-934 (2009).
- Stöckli, J., et al. The RabGAP TBC1D1 plays a central role in exercise-regulated glucose metabolism in skeletal muscle. Diabetes. 64 (6), 1914-1922 (2015).
- Jørgensen, S. B., et al. Knockout of the alpha2 but not alpha1 5′-AMP-activated protein kinase isoform abolishes 5-aminoimidazole-4-carboxamide-1-beta-4-ribofuranosidebut not contraction-induced glucose uptake in skeletal muscle. The Journal of Biological Chemistry. 279 (2), (2004).
- Kjøbsted, R., et al. Prior AICAR stimulation increases insulin sensitivity in mouse skeletal muscle in an AMPK-dependent manner. Diabetes. 64 (6), 2042-2055 (2015).
- Lantier, L., et al. AMPK controls exercise endurance, mitochondrial oxidative capacity, and skeletal muscle integrity. FASEB Journal. 28 (7), 3211-3224 (2014).
- Cokorinos, E. C., et al. Activation of skeletal muscle AMPK promotes glucose disposal and glucose lowering in non-human primates and mice. Cell Metabolism. 25 (5), 1147-1159 (2017).
- Bonen, A., Clark, M. G., Henriksen, E. J. Experimental approaches in muscle metabolism: hindlimb perfusion and isolated muscle incubations. The American Journal of Physiology. 266, 1-16 (1994).
- van Breda, E., Keizer, H. A., Glatz, J. F., Geurten, P. Use of the intact mouse skeletal-muscle preparation for metabolic studies. Evaluation of the model. The Biochemical Journal. 267 (1), 257-260 (1990).
- Sogaard, P., et al. Effects of fibre type and diffusion distance on mouse skeletal muscle glycogen content in vitro. Journal of Cellular Biochemistry. 107 (6), 1189-1197 (2009).
- Lowry, O. H., Passonneau, J. V. Typical fluorometric procedures for metabolite assays. A Flexible System of Enzymatic Analysis. , 68-92 (1972).
- Jensen, T. E., et al. Contraction-stimulated glucose transport in muscle is controlled by AMPK and mechanical stress but not sarcoplasmatic reticulum Ca(2+) release. Molecular Metabolism. 3 (7), 742-753 (2014).
- Kristensen, J. M., Treebak, J. T., Schjerling, P., Goodyear, L., Wojtaszewski, J. F. P. Two weeks of metformin treatment induces AMPK-dependent enhancement of insulin-stimulated glucose uptake in mouse soleus muscle. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 306 (10), 1099-1109 (2014).
- Szekeres, F., et al. The Rab-GTPase-activating protein TBC1D1 regulates skeletal muscle glucose metabolism. AJP: Endocrinology and Metabolism. 303 (4), 524-533 (2012).
- Pehmøller, C., et al. Genetic disruption of AMPK signaling abolishes both contraction- and insulin-stimulated TBC1D1 phosphorylation and 14-3-3 binding in mouse skeletal muscle. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 297 (3), 665-675 (2009).
- Ryder, J. W., Bassel-Duby, R., Olson, E. N., Zierath, J. R. Skeletal muscle reprogramming by activation of calcineurin improves insulin action on metabolic pathways. The Journal of Biological Chemistry. 278 (45), 44298-44304 (2003).
- Long, Y. C., Glund, S., Garcia-Roves, P. M., Zierath, J. R. Calcineurin regulates skeletal muscle metabolism via coordinated changes in gene expression. The Journal of Biological Chemistry. 282 (3), 1607-1614 (2007).
- Bloemberg, D., Quadrilatero, J. Rapid determination of myosin heavy chain expression in rat, mouse, and human skeletal muscle using multicolor immunofluorescence analysis. PloS One. 7 (4), 35273 (2012).
- Roche, S. M., Gumucio, J. P., Brooks, S. V., Mendias, C. L., Claflin, D. R. Measurement of maximum isometric force generated by permeabilized skeletal muscle fibers. Journal of Visualized Experiments. (100), e52695 (2015).
- Park, K. H., et al. Ex vivo assessment of contractility, fatigability and alternans in isolated skeletal muscles. Journal of Visualized Experiments. (69), e4198 (2012).
- Tullson, P. C., Terjung, R. L. Adenine nucleotide metabolism in contracting skeletal muscle. Exercise and Sport Sciences Reviews. 19, 507-537 (1991).
- Wojtaszewski, J. F., Jakobsen, A. B., Ploug, T., Richter, E. A. Perfused rat hindlimb is suitable for skeletal muscle glucose transport measurements. The American Journal of Physiology. 274 (1), 184-191 (1998).
- Hansen, P. A., Gulve, E. A., Holloszy, J. O. Suitability of 2-deoxyglucose for in vitro measurement of glucose transport activity in skeletal muscle. Journal of AppliedPhysiology. 76 (2), 979-985 (1994).
- Watson-Wright, W. M., Tan, M. H., Bonen, A. Insulin binding and 2-deoxy-D-glucose uptake in fast- and slow-twitch mouse skeletal muscle at 18 and 37 degrees C. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 62 (12), 1460-1465 (1984).
- Hansen, P. A., Marshall, B. A., Chen, M., Holloszy, J. O., Mueckler, M. Transgenic overexpression of hexokinase II in skeletal muscle does not increase glucose disposal in wild-type or Glut1-overexpressing mice. The Journal of Biological Chemistry. 275 (29), (2000).
- Virkamäki, A., Rissanen, E., Hämäläinen, S., Utriainen, T., Yki-Järvinen, H. Incorporation of [3-3H]glucose and 2-[1-14C]deoxyglucose into glycogen in heart and skeletal muscle in vivo: implications for the quantitation of tissue glucose uptake. Diabetes. 46 (7), 1106-1110 (1997).
- Bhave, G., Neilson, E. G. Body fluid dynamics: back to the future. Journal of the American Society of Nephrology JASN. 22 (12), 2166-2181 (2011).
- Eckel-Mahan, K., Sassone-Corsi, P. Metabolism and the circadian clock converge. Physiological Reviews. 93 (1), 107-135 (2013).
- Dyar, K. A., et al. Muscle insulin sensitivity and glucose metabolism are controlled by the intrinsic muscle clock. Molecular Metabolism. 3 (1), 29-41 (2014).
- Basse, A. L., et al. Skeletal muscle insulin sensitivity show circadian rhythmicity which is independent of exercise training status. Frontiers in Physiology. 9, 1198 (2018).
- Segal, S. S., Faulkner, J. A. Temperature-dependent physiological stability of rat skeletal muscle in vitro. American Journal of Physiology – Cell Physiology. 248 (3), 265-270 (1985).
- Wallberg-Henriksson, H. Glucose transport into skeletal muscle. Influence of contractile activity, insulin, catecholamines and diabetes mellitus. Acta Physiologica Scandinavica. Supplementum. 564, 1-80 (1987).
- Alkhateeb, H., Chabowski, A., Bonen, A. Viability of the isolated soleus muscle during long-term incubation. Applied Physiology, Nutrition, and Metabolism. 31 (4), 467-476 (2006).
- Cleland, P. J., Rattigan, S., Clark, M. G. Glucose-induced loss of exercise-mediated 3-0-methyl glucose uptake by isolated rat soleus and epitrochlearis muscles. Hormone and Metabolic Research. 22 (2), 121-122 (1990).
- Gulve, E. A., Cartee, G. D., Holloszy, J. O. Prolonged incubation of skeletal muscle in vitro: prevention of increases in glucose transport. The American Journal of Physiology. 261 (1), 154-160 (1991).
- Deshmukh, A. S., et al. Deep proteomics of mouse skeletal muscle enables quantitation of protein isoforms, metabolic pathways, and transcription factors. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (4), 841-853 (2015).
- Rudich, A., Klip, A. Push/pull mechanisms of GLUT4 traffic in muscle cells. Acta physiologica Scandinavica. 178 (4), 297-308 (2003).
- Kjøbsted, R., et al. Enhanced muscle insulin sensitivity after contraction/exercise is mediated by AMPK. Diabetes. 66 (3), 598-612 (2017).
- Kjøbsted, R., et al. TBC1D4 is necessary for enhancing muscle insulin sensitivity in response to AICAR and contraction. Diabetes. 68 (9), 1756-1766 (2019).
