Misurazione dell'assorbimento di glucosio stimolato da insulina e contrazione in muscolo scheletrico maturo isolato e incubato da topi
Summary
La regolazione intatta dell’assorbimento del glucosio muscolare è importante per mantenere l’omeostasi del glucosio in tutto il corpo. Questo protocollo presenta la valutazione dell’assorbimento di glucosio stimolato dall’insulina e dalla contrazione nel muscolo scheletrico maturo isolato e incubato quando delinea l’impatto di vari interventi fisiologici sul metabolismo del glucosio di tutto il corpo.
Abstract
Il muscolo scheletrico è un tessuto insulino-responsivo e in genere assorbe la maggior parte del glucosio che entra nel sangue dopo un pasto. Inoltre, è stato riportato che il muscolo scheletrico può aumentare l’estrazione di glucosio dal sangue fino a 50 volte durante l’esercizio rispetto alle condizioni di riposo. L’aumento dell’assorbimento del glucosio muscolare durante l’esercizio fisico e la stimolazione dell’insulina dipende dalla traslocazione del trasportatore di glucosio 4 (GLUT4) dai compartimenti intracellulari alla membrana della superficie delle cellule muscolari, nonché dalla fosforilazione del glucosio in glucosio-6-fosfato da parte dell’esochinasi II. L’isolamento e l’incubazione di muscoli di topo come m. soleus e m. extensor digitorum longus (EDL) è un modello ex vivo appropriato per studiare gli effetti dell’insulina e della contrazione indotta elettricamente (un modello per l’esercizio) sull’assorbimento del glucosio nel muscolo scheletrico maturo. Pertanto, il modello ex vivo consente la valutazione della sensibilità all’insulina muscolare e consente di abbinare la produzione di forza muscolare durante la contrazione garantendo un reclutamento uniforme delle fibre muscolari durante le misurazioni dell’assorbimento del glucosio muscolare. Inoltre, il modello descritto è adatto per i test farmacologici dei composti che possono avere un impatto sulla sensibilità all’insulina muscolare o possono essere di aiuto quando si cerca di delineare la complessità regolatoria dell’assorbimento del glucosio nel muscolo scheletrico.
Qui descriviamo e forniamo un protocollo dettagliato su come misurare l’assorbimento di glucosio stimolato dall’insulina e dalla contrazione in preparati muscolari isolati e incubati di soleo ed EDL da topi usando radiomarcato [3H]2-deossi-D-glucosio e [14C]mannitolo come marcatore extracellulare. Ciò consente una valutazione accurata dell’assorbimento di glucosio nel muscolo scheletrico maturo in assenza di fattori confondenti che possono interferire nel modello animale intatto. Inoltre, forniamo informazioni sulla vitalità metabolica del muscolo scheletrico del topo incubato suggerendo che il metodo applicato possiede alcuni avvertimenti in determinate condizioni quando si studia il metabolismo energetico muscolare.
Introduction
Il muscolo scheletrico possiede la capacità di estrarre grandi quantità di glucosio dallo spazio extracellulare in risposta all’insulina e all’esercizio fisico. Questo aiuta a mantenere l’omeostasi del glucosio in tutto il corpo e assicura l’approvvigionamento di glucosio durante i periodi di elevata domanda di energia. Poiché la regolazione intatta dell’assorbimento del glucosio nei muscoli scheletrici ha dimostrato di essere importante per la salute generale e le prestazioni fisiche 1,2, le misurazioni dell’assorbimento del glucosio muscolare durante varie condizioni hanno ricevuto molta attenzione. Nell’uomo e negli animali, il morsetto iperinsulinemico-euglicemico è stato utilizzato come tecnica gold standard per valutare la sensibilità all’insulina in vivo 3,4. In contrasto con i risultati ottenuti da un test di tolleranza al glucosio orale, la tecnica del morsetto iperinsulinemico-euglycemic non richiede una funzione gastrointestinale intatta o la secrezione di insulina dal pancreas e consente quindi di confrontare le risposte insuliniche tra soggetti che presentano variazioni nella funzione gastro-intestinale e/o pancreatica. Le misurazioni dell’assorbimento di glucosio muscolare in vivo durante l’esercizio negli esseri umani sono state eseguite frequentemente dal 19605. Prima con l’uso di tecniche di equilibrio artero-venoso6 e successivamente con l’uso della tomografia ad emissione di positroni (PET) in combinazione con un analogo del glucosio che emette positroni, ad esempio 18F-Fluoro-deossi-glucosio7. Nei roditori, l’assorbimento di glucosio muscolare stimolato dall’esercizio in vivo viene tipicamente eseguito mediante l’uso di analoghi del glucosio radioattivi o isotopici stabili 8,9,10.
Un metodo complementare alle misurazioni dell’assorbimento muscolare di glucosio in vivo consiste nell’isolare e incubare piccoli muscoli dai roditori e successivamente misurare l’assorbimento del glucosio utilizzando analoghi del glucosio radioattivi o stabili marcati con isotopi 11,12,13. Questo metodo consente una quantificazione accurata e affidabile dei tassi di assorbimento del glucosio nel muscolo scheletrico maturo e può essere eseguito in presenza di varie concentrazioni di insulina e durante la contrazione suscitata dalla stimolazione elettrica. Ancora più importante, le misurazioni dell’assorbimento di glucosio nel muscolo scheletrico isolato e incubato sono rilevanti quando si studia il fenotipo metabolico muscolare di topi che hanno subito vari interventi (ad esempio nutrizione, attività fisica, infezioni, terapie). Il modello di muscolo scheletrico isolato è anche uno strumento adatto per i test farmacologici dei composti che possono influenzare l’assorbimento del glucosio di per sé e / o modificare la sensibilità all’insulina12,14. In questo modo, l’efficacia dei composti progettati per regolare il metabolismo del glucosio muscolare può essere testata e valutata in un ambiente altamente controllato prima di successivi test in vivo in modelli animali pre-clinici.
In alcune condizioni, la vitalità metabolica può rappresentare una sfida nel sistema modello muscolare scheletrico isolato e incubato. Infatti, la mancanza di un sistema circolatorio nei muscoli incubati comporta che l’erogazione di substrati (ad esempio ossigeno e sostanze nutritive) dipenda completamente dalla semplice diffusione tra le fibre muscolari e l’ambiente circostante. A questo proposito, è importante che i muscoli incubati siano piccoli e sottili e quindi rappresentino meno di una barriera per la diffusione dell’ossigeno durante l’incubazione15. Soprattutto durante le incubazioni prolungate per diverse ore, possono svilupparsi stati ipossici a causa di un insufficiente apporto di ossigeno con conseguente esaurimento dell’energia muscolare15. Sebbene in precedenza siano stati riportati vari marcatori di vitalità metabolica nel muscolo di ratto incubato insieme all’identificazione di importanti variabili che aiutano a mantenere la vitalità muscolare del ratto15, una valutazione completa della vitalità metabolica nei piccoli muscoli di topo incubati è ancora giustificata. Quindi, allo stato attuale, il contenuto di glicogeno è stato utilizzato principalmente come marcatore di vitalità metabolica nel muscolo scheletrico del topo incubato16,17.
Qui descriviamo un protocollo dettagliato per misurare l’assorbimento di glucosio basale, insulino-stimolato e contrazione nel soleo isolato e incubato e nel muscolo EDL dai topi usando il [3H]2-deossi-D-glucosio radiomarcato e [14C]mannitolo come marcatore extracellulare. Nel presente studio, l’assorbimento di glucosio è stato misurato durante un periodo di 10 minuti e il metodo è presentato con l’uso di concentrazioni di insulina submassimili e massimamente efficaci, nonché un singolo protocollo di contrazione. Tuttavia, i protocolli qui descritti possono essere facilmente modificati per quanto riguarda il tempo di incubazione, il dosaggio dell’insulina e il protocollo di stimolazione elettrica. Inoltre, forniamo una caratterizzazione approfondita di vari marcatori di vitalità metabolica nel soleo incubato e nel muscolo di topo EDL. I risultati indicano che l’integrazione di glucosio nel tampone di incubazione è essenziale per preservare la vitalità metabolica del muscolo incubato per 1 ora.
Protocol
Representative Results
Discussion
La regolazione intatta dell’assorbimento del glucosio nel muscolo scheletrico è importante per preservare la salute generale1. Pertanto, l’indagine sull’assorbimento del glucosio muscolare spesso funge da lettura primaria quando si valutano vari interventi che alterano la salute. Qui descriviamo un metodo ex vivo per misurare l’assorbimento di glucosio nel soleo isolato e incubato e nel muscolo EDL dai topi in risposta all’insulina e alle contrazioni indotte elettricamente. Il metodo è rapido e …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del Danish Council for Independent Research – Medical Sciences (FSS8020-00288B) e della Novo Nordisk Foundation (NNF160C0023046). Questo lavoro è stato anche supportato da una borsa di ricerca a Rasmus Kjøbsted della Danish Diabetes Academy, che è finanziata dalla Novo Nordisk Foundation, numero di sovvenzione NNF17SA0031406. Gli autori desiderano ringraziare Karina Olsen, Betina Bolmgren e Irene Bech Nielsen (Dipartimento di Nutrizione, Esercizio e Sport, Facoltà di Scienze, Università di Copenaghen) per la loro assistenza tecnica qualificata.
Materials
| [14C]D-mannitol | American Radiolabeled Chemicals, Inc. | ARC 0127 | |
| [3H]2-deoxy-D-glucose | American Radiolabeled Chemicals, Inc. | ART 0103A | |
| 2-Deoxy-D-glucose | Sigma | D8375 | |
| 4-0 USP non-sterile surgical nylon suture | Harvard Apparatus | 51-7698 | |
| Streptavidin/HRP (Conjugate) | DAKO | P0397 | Used to detect ACC protein |
| Akt2 antibody | Cell Signaling | 3063 | |
| AMPKα2 antibody | Santa Cruz | SC-19131 | |
| aprotinin | Sigma | A1153 | |
| benzamidine | Sigma | B6505 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7030 | |
| CaCl2 | Merck | 1020831000 | |
| Calibration kit (force) | Danish Myo Technology A/S | 300041 | |
| Chemiluminescence | Millipore | WBLUF0500 | |
| D-Glucose | Merck | 1084180100 | |
| D-Mannitol | Sigma | M4125 | |
| Data collection program | National Instruments | LabVIEW software version 7.1 | |
| Dialysis tubing | Visking | DTV.12000.09 Size No.9 | |
| Digital imaging system | BioRad | ChemiDoc MP | |
| EDTA | Sigma EDS | E9884 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| Electrical Pulse Stimulator | Digitimer | D330 MultiStim System | |
| Glycerol | Sigma | G7757 | |
| HEPES | Sigma | H7637 | |
| IGEPAL CA-630 | Sigma | I8896 | |
| Insulin | Novo Nordisk | Actrapid, 100 IE/mL | |
| KCl | Merck | 1049361000 | |
| KH2PO4 | Merck | 104873025 | |
| leupeptin | Sigma | L2884 | |
| MgSO4 | Merck | 1058860500 | |
| Muscle Strip Myograph System | Danish Myo Technology A/S | Model 820MS | |
| Na-Orthovanadate | Sigma | S6508 | |
| Na-Pyrophosphate | Sigma | 221368 | |
| Na-Pyruvate | Sigma | P2256 | |
| NaCl | Merck | 106041000 | |
| NaF | Sigma | S1504 | |
| NaHCO3 | VWR | 27778260 | |
| pACC Ser212 antibody | Cell Signaling | 3661 | |
| pAkt Thr308 antibody | Cell Signaling | 9275 | |
| pAMPK Thr172 antibody | Cell Signaling | 2531 | |
| phenylmethylsulfonylfluoride | Sigma | P7626 | |
| Platinum electrodes | Danish Myo Technology A/S | 300145 | |
| pTBC1D4 Ser588 antibody | Cell Signaling | 8730 | |
| Scintillation counter | Perkin Elmer | Tri-Carb-2910TR | |
| Scintillation fluid | Perkin Elmer | 6013329 | |
| Statistical analyses software | Systat | SigmaPlot version 14 | |
| TBC1D4 antibody | Abcam | ab189890 | |
| TissueLyser II | Qiagen | 85300 | |
| Ultrapure water | Merck | Milli-Q Reference A+ System | |
| β-glycerophosphate | Sigma | G9422 |
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