マウスから単離およびインキュベートされた成熟骨格筋におけるインスリンおよび収縮刺激グルコース取り込みの測定
Summary
筋肉グルコース取り込みの無傷の調節は、全身グルコース恒常性を維持するために重要である。このプロトコルは、全身のグルコース代謝に対する様々な生理学的介入の影響を描写する際に、単離およびインキュベートされた成熟骨格筋におけるインスリンおよび収縮刺激グルコース取り込みの評価を提示する。
Abstract
骨格筋はインスリン応答性組織であり、典型的には食事後に血液に入るグルコースの大部分を吸収する。また、骨格筋は、運動中に血液からのグルコースの抽出を安静時に比べて最大50倍に増加させることが報告されている。運動およびインスリン刺激中の筋肉グルコース取り込みの増加は、細胞内区画から筋細胞表面膜へのグルコーストランスポーター4(GLUT4)の転座、ならびにヘキソキナーゼIIによるグルコースのグルコース-6-リン酸へのリン酸化に依存する。ミレやm.エクステンサー・デジトルム・ロンガス(EDL)などのマウス筋肉の単離とインキュベーションは、成熟骨格筋におけるグルコース取り込みに対するインスリンおよび電気的に誘発された収縮(運動のためのモデル)の影響を研究するための適切なエクスビボモデルである。したがって、ex vivoモデルは、筋インスリン感受性の評価を可能にし、収縮中の筋力産生を一致させ、筋グルコース取り込みの測定中に筋線維の均一な動員を保証することを可能にする。さらに、記載されたモデルは、筋インスリン感受性に影響を与え得るか、または骨格筋グルコース取り込みの調節的複雑さを描写しようとする際に有用であり得る薬理学的化合物試験に適している。
ここでは、放射性標識された[3H]2-デオキシ-D-グルコースおよび[14C]マンニトールを細胞外マーカーとして用いて、マウスから単離およびインキュベートしたヒラメおよびEDL筋肉調製物におけるインスリンおよび収縮刺激グルコース取り込みを測定する方法に関する詳細なプロトコールを記載および提供する。これにより、無傷の動物モデルに干渉し得る交絡因子の非存在下での成熟骨格筋におけるグルコース取り込みの正確な評価が可能になる。さらに、我々は、インキュベートされたマウス骨格筋の代謝生存率に関する情報を提供し、筋肉エネルギー代謝を研究する際に、適用された方法が特定の条件下でいくつかの注意点を有することを示唆している。
Introduction
骨格筋は、インスリンおよび運動に応答して細胞外空間から大量のグルコースを抽出する能力を有する。これは、全身のグルコース恒常性を維持するのに役立ち、高いエネルギー需要の時にグルコース供給を確保します。骨格筋グルコース取り込みの無傷の調節が全体的な健康および身体能力にとって重要であることが示されているので1,2、様々な状態における筋肉グルコース取り込みの測定は多くの注目を集めている。ヒトおよび動物において、高インスリン血症 – 正常血糖クランプは、インビボでのインスリン感受性を評価するためのゴールドスタンダード技術として使用されている3,4。経口糖負荷試験から得られた所見とは対照的に、高インスリン血糖 – 正常血糖クランプ技術は、無傷の胃腸機能または膵臓からのインスリン分泌を必要としないため、胃腸および/または膵臓機能に変動を示す被験者間でインスリン応答を比較することを可能にする。ヒトにおける運動中の生体内での筋肉グルコース取り込みの測定は、1960年代から頻繁に行われてきた5。最初に動静脈平衡技術6の使用によって、そして後に陽電子放出グルコース類似体例えば18F−フルオロデオキシグルコース7と組み合わせた陽電子放出断層撮影(PET)画像化の使用による。げっ歯類において、運動刺激筋肉インビボでのグルコース取り込みは、典型的には、放射性または安定同位体標識グルコース類似体8、9、10の使用によって行われる。
インビボでの筋肉グルコース取り込みの測定に相補的な方法は、げっ歯類から小筋肉を単離およびインキュベートし、続いて放射性または安定同位体標識グルコース類似体を用いてグルコース取り込みを測定することである11、12、13。この方法は、成熟骨格筋におけるグルコース取り込み速度の正確かつ信頼性の高い定量を可能にし、様々なインスリン濃度の存在下で、および電気刺激によって誘発される収縮中に行うことができる。さらに重要なことに、単離およびインキュベートされた骨格筋におけるグルコース取り込みの測定は、様々な介入(例えば栄養、身体活動、感染、治療薬)を受けたマウスの筋肉代謝表現型を調査する際に関連性がある。単離された骨格筋モデルは、グルコース取り込み自体に影響を及ぼし、および/またはインスリン感受性を変化させる可能性のある薬理学的化合物試験のための適切なツールでもある12,14。このようにして、筋肉グルコース代謝を調節するように設計された化合物の有効性を、前臨床動物モデルにおけるその後のin vivo試験の前に、高度に制御された環境で試験および評価することができる。
いくつかの条件下では、代謝生存率は、単離およびインキュベートされた骨格筋モデル系において課題を提起し得る。実際、インキュベートされた筋肉における循環系の欠如は、基質(例えば酸素および栄養素)の送達が筋線維と周囲の環境との間の単純な拡散に完全に依存することを伴う。これに関して、インキュベートされた筋肉が小さくて薄く、したがって、インキュベーション中の酸素拡散のための障壁が少ないことが重要である15。特に数時間の長時間のインキュベーション中に、酸素供給が不十分で筋肉エネルギーが枯渇するため、低酸素状態が発症することがあります15。インキュベートされたラット筋肉における代謝生存率の様々なマーカーが、ラット筋肉の生存率を維持するのに役立つ重要な変数の同定とともに以前に報告されているが15、小さなインキュベートされたマウス筋肉における代謝生存率の包括的な評価は依然として正当化される。したがって、現在のところ、グリコーゲン含量は、主にインキュベートされたマウス骨格筋における代謝生存率のマーカーとして使用されている16、17。
ここでは、放射性標識された[3H]2-デオキシ-D-グルコースおよび[14C]マンニトールを細胞外マーカーとして用いて、マウスから単離およびインキュベートしたヒラメ筋およびEDL筋における基礎、インスリンおよび収縮刺激グルコース取り込みを測定するための詳細なプロトコールについて説明する。本研究では、グルコース取り込みを10分間に測定し、この方法は、サブ最大および最大に有効なインスリン濃度ならびに単一の収縮プロトコールの使用を提示する。しかしながら、本明細書に記載されるプロトコルは、インキュベーション時間、インスリン投与量、および電気刺激プロトコルに関して容易に変更することができる。さらに、インキュベートされたヒラメおよびEDLマウス筋肉における代謝生存率の様々なマーカーの徹底的な特徴付けを提供する。この結果は、インキュベーションバッファーへのグルコース補給が、1時間インキュベートした筋肉の代謝生存率を維持するために不可欠であることを示している。
Protocol
Representative Results
Discussion
骨格筋におけるグルコース取り込みの無傷の調節は、全体的な健康を維持するために重要である1。したがって、筋肉のグルコース取り込みの調査は、様々な健康を変える介入を評価する際の主要な読み出しとしてしばしば役立つ。ここで我々は、インスリンおよび電気的に誘導された収縮に応答してマウスから単離およびインキュベートされたヒラメおよびEDL筋肉における…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、デンマーク独立研究医学評議会(FSS8020-00288B)とノボノルディスク財団(NNF160C0023046)からの助成金によって支援されました。この研究は、ノボノルディスク財団の助成金番号NNF17SA0031406からデンマーク糖尿病アカデミーからラスムス・キョブステッドへの研究助成金によっても支援されました。著者らは、カリーナ・オルセン、ベティナ・ボルムグレン、アイリーン・ベック・ニールセン(コペンハーゲン大学理学部栄養・運動・スポーツ学科)の熟練した技術支援に感謝したい。
Materials
| [14C]D-mannitol | American Radiolabeled Chemicals, Inc. | ARC 0127 | |
| [3H]2-deoxy-D-glucose | American Radiolabeled Chemicals, Inc. | ART 0103A | |
| 2-Deoxy-D-glucose | Sigma | D8375 | |
| 4-0 USP non-sterile surgical nylon suture | Harvard Apparatus | 51-7698 | |
| Streptavidin/HRP (Conjugate) | DAKO | P0397 | Used to detect ACC protein |
| Akt2 antibody | Cell Signaling | 3063 | |
| AMPKα2 antibody | Santa Cruz | SC-19131 | |
| aprotinin | Sigma | A1153 | |
| benzamidine | Sigma | B6505 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7030 | |
| CaCl2 | Merck | 1020831000 | |
| Calibration kit (force) | Danish Myo Technology A/S | 300041 | |
| Chemiluminescence | Millipore | WBLUF0500 | |
| D-Glucose | Merck | 1084180100 | |
| D-Mannitol | Sigma | M4125 | |
| Data collection program | National Instruments | LabVIEW software version 7.1 | |
| Dialysis tubing | Visking | DTV.12000.09 Size No.9 | |
| Digital imaging system | BioRad | ChemiDoc MP | |
| EDTA | Sigma EDS | E9884 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| Electrical Pulse Stimulator | Digitimer | D330 MultiStim System | |
| Glycerol | Sigma | G7757 | |
| HEPES | Sigma | H7637 | |
| IGEPAL CA-630 | Sigma | I8896 | |
| Insulin | Novo Nordisk | Actrapid, 100 IE/mL | |
| KCl | Merck | 1049361000 | |
| KH2PO4 | Merck | 104873025 | |
| leupeptin | Sigma | L2884 | |
| MgSO4 | Merck | 1058860500 | |
| Muscle Strip Myograph System | Danish Myo Technology A/S | Model 820MS | |
| Na-Orthovanadate | Sigma | S6508 | |
| Na-Pyrophosphate | Sigma | 221368 | |
| Na-Pyruvate | Sigma | P2256 | |
| NaCl | Merck | 106041000 | |
| NaF | Sigma | S1504 | |
| NaHCO3 | VWR | 27778260 | |
| pACC Ser212 antibody | Cell Signaling | 3661 | |
| pAkt Thr308 antibody | Cell Signaling | 9275 | |
| pAMPK Thr172 antibody | Cell Signaling | 2531 | |
| phenylmethylsulfonylfluoride | Sigma | P7626 | |
| Platinum electrodes | Danish Myo Technology A/S | 300145 | |
| pTBC1D4 Ser588 antibody | Cell Signaling | 8730 | |
| Scintillation counter | Perkin Elmer | Tri-Carb-2910TR | |
| Scintillation fluid | Perkin Elmer | 6013329 | |
| Statistical analyses software | Systat | SigmaPlot version 14 | |
| TBC1D4 antibody | Abcam | ab189890 | |
| TissueLyser II | Qiagen | 85300 | |
| Ultrapure water | Merck | Milli-Q Reference A+ System | |
| β-glycerophosphate | Sigma | G9422 |
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