Bloqueo del flujo linfático mediante la sutura de los vasos linfáticos aferentes en ratones
Summary
Se presenta un protocolo para bloquear el flujo linfático mediante la sutura quirúrgica de los vasos linfáticos aferentes.
Abstract
Los vasos linfáticos son fundamentales para mantener el equilibrio de líquidos tisulares y optimizar la protección inmune mediante el transporte de antígenos, citoquinas y células a los ganglios linfáticos de drenaje (LN). La interrupción del flujo linfático es un método importante al estudiar la función de los vasos linfáticos. Los vasos linfáticos aferentes desde la almohadilla murina hasta los ganglios linfáticos popliteales (pNN) están bien definidos como las únicas rutas para el drenaje linfático en los pNN. Suturar estos vasos linfáticos aferentes puede prevenir selectivamente el flujo linfático a los pNN. Este método permite la interferencia en el flujo linfático con un daño mínimo a las células endoteliales linfáticas en el pLN drenante, los vasos linfáticos aferentes, así como otros vasos linfáticos alrededor de la zona. Este método se ha utilizado para estudiar cómo afecta la linfa los altos veules endoteliales (HEV) y la expresión de quimiocina en el LN, y cómo la linfa fluye a través del tejido adiposo que rodea el LN en ausencia de vasos linfáticos funcionales. Con el creciente reconocimiento de la importancia de la función linfática, este método tendrá aplicaciones más amplias para desentrañar aún más la función de los vasos linfáticos en la regulación del microambiente LN y las respuestas inmunitarias.
Introduction
La organización espacial del sistema linfático proporciona soporte estructural y funcional para eliminar eficientemente el líquido extracelular y transportar antígenos y células que presentan antígenos (APC) a los LN drenantes. Los vasos linfáticos iniciales (también llamados capilares linfáticos) son altamente permeables debido a sus uniones intercelulares discontinuas, que facilitan la recolección efectiva de líquidos, células y otros materiales de los espacios extracelulares circundantes1. Los vasos linfáticos iniciales se funden en vasos linfáticos recolectan, que tienen uniones intercelulares estrechas, una membrana sótano continua y cobertura muscular linfática. La recolección de los vasos linfáticos son responsables de transportar la linfa recogida a los LN drenantes y eventualmente devolver la linfa a la circulación2,3. Los vasos linfáticos recolectantes que introducen la linfa en el LN drenante son los vasos linfáticos aferentes4,5,6,7. La obstrucción de los vasos linfáticos aferentes puede bloquear el flujo linfático hacia los LN, que es una técnica útil al estudiar la función del flujo linfático.
Estudios anteriores han demostrado que el flujo linfático juega un papel importante en el transporte de antígenos y APC, así como el mantenimiento de la homeostasis LN. Se entiende bien que los APC derivados del tejido, típicamente activados células dendríticas migratorias (DC), viajan a través de los vasos linfáticos aferentes a la LN para activar las células T8. La idea de que los antígenos de forma libre, como microbios o antígenos solubles, fluyen pasivamente con linfa a la LN para activar los APC residentes en LN ha ido ganando aceptación en la última década9,10,11,12. Los antígenos de forma libre que viajan con la linfa tardan minutos después de la infección para viajar al LN, y la activación de la célula residente en LN puede ocurrir dentro de los 20 minutos después de la estimulación. Esto es mucho más rápido que la activación de controladores de dominio de migración, que tarda más de 8 h en entrar en el LN9de drenaje. Además de transportar antígenos para iniciar la protección inmunitaria, la linfa también lleva citoquinas y DC a la LN para mantener su microambiente, y para apoyar la homeostasis de células inmunitarias13,14. Anteriormente, el bloqueo del flujo linfático suturando los vasos linfáticos aferentes demostró que la linfa es necesaria para mantener el fenotipo HEV necesario para apoyar la célula T homeostática y la localización de células B a la LN15,16,17. CCL21 es una quimiocina crítica que dirige el posicionamiento de células DC y T en el LN8,18. El bloqueo del flujo linfático interrumpe la expresión CCL21 en el LN y puede interrumpir el posicionamiento y/o la interacción de los células DC y T en el LN19. Por lo tanto, el bloqueo del flujo linfático puede abrogar directa o indirectamente el acceso de antígeno/CC al LN drenante interrumpiendo el microambiente LN que regula las respuestas inmunitarias en el LN. Para investigar mejor la función del flujo linfático, se presenta un protocolo experimental (Figura 1) para bloquear el flujo linfático en ratones suturando los vasos linfáticos aferentes desde la almohadilla hasta el pLN. Este método puede ser una técnica importante para futuros estudios sobre la función linfática en condiciones saludables y enfermas.
Protocol
Representative Results
Discussion
El bloqueo del flujo linfático tendrá amplias aplicaciones en la manipulación del suministro de antígenos al LN en condiciones saludables y enfermas. Es posible utilizar este método para controlar el momento de la administración de antígenos con el fin de estudiar cómo el flujo linfático continuo regula la respuesta inmune en el drenaje de LNs. Este método de interrupción del flujo linfático también se puede utilizar para estudiar cómo afecta la linfa a la compartimentación celular, la activación celular,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen a Ava Zardynezhad por la corrección del manuscrito. Este trabajo cuenta con el apoyo del Instituto Canadiense de Investigación Sanitaria (CIHR, PJT-156035) y la Fundación Canadiense para la Innovación para SL (32930), y por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China para Yujia Linjia (81901576).
Materials
| 0.9% Sodium Chloride Saline | Baxter | JB1323 | |
| 100% ethanol | Greenfield Global | University of Calgary distribution services UN1170. | |
| Depilatory cream | Nair | Nair Sensitive Formula Hair Removal Crème with Sweet Almond Oil and Baby Oil, 200-ml. Or similar product. | |
| Evans Blue dye | Sigma Life Science | E2129-10G | For 1 ml of Evans blue dye, add 0.1g Evans blue to 10 ml PBS. The Evens Blue solution will be filtered through 0.22 mm filters and kept sterile in 1ml aliquots. |
| Fluorescein isothiocyanate isomer I (FITC) | Sigma Life Science | F7250-1G | |
| Forceps Dumont #3 | WPI | 500337 | |
| Forceps Dumont #5 | WPI | 500233 | |
| Injection apparatus | Connect one end of polyethylene tubing to 30G × ½ needle. Attach a 1ml TB syringe to the needle. Dislodge needle shaft from another 30G × ½ needle. Insert the blunt end of the 30G × ½ needle shaft into the other end of the tubing. The inside diameter of this tubing is 0.28mm. Thus, 1.6 cm of fluid in the tubing is 1 μl. | ||
| Insulin syringe | Becton Dickinson and Company (BD) | 329461 | |
| IRIS Forcep straight | WPI | 15914 | |
| IRIS scissors | WPI | 14218-G | |
| Ketamine | Narketan | DIN 02374994 | The suppliers of Ketamine and Xylazine are usually under institutional and governmental regulation. |
| Needles (26Gx3/8) | Becton Dickinson and Company (BD) | 305110 | |
| Needles (30Gx1/2) | Becton Dickinson and Company (BD) | 305106 | |
| Paton Needle Holder | ROBOZ | RS6403 | Straight, Without Lock; Serrated |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Sigma Life Science | P4417-100TAB | |
| Polyethylene tubing | Becton Dickinson and Company (BD) | 427401 | |
| Surgical tape (1.25cmx9.1m ) | Transpore | 1527-0 | |
| Surgical tape (2.5cmx9.1m ) | Transpore | 1527-1 | |
| Suture | Davis and Geck CYANAMID Canada | 11/04 | 0.7 metric monofilament polypropylene |
| Syringe (1ml) | Becton Dickinson and Company (BD) | 309659 | |
| VANNAS scissors | World Precision Instruments (WPI) | 14122-G | |
| Xylazine | Rompun | DIN02169606 | The suppliers of Ketamine and Xylazine are usually under institutional and governmental regulation. |
| Equipment | |||
| Dissecting microscope | Olympus | Olympus S261 (522-STS OH141791) with light source: Olympus Highlight 3100 | |
| Confocal microscope | Leica | SP8 |
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