Summary

Blocage du flux lymphatique par suturing vaisseaux lymphatiques afferent chez la souris

Published: May 14, 2020
doi:

Summary

Un protocole pour bloquer le flux lymphatique par suturing chirurgical des vaisseaux lymphatiques afferents est présenté.

Abstract

Les vaisseaux lymphatiques sont essentiels au maintien de l’équilibre des fluides tissulaires et à l’optimisation de la protection immunitaire en transportant des antigènes, des cytokines et des cellules vers les ganglions lymphatiques drainants (LN). L’interruption du flux lymphatique est une méthode importante lors de l’étude de la fonction des vaisseaux lymphatiques. Les vaisseaux lymphatiques afferents du pied murin aux ganglions lymphatiques popliteal (pLNs) sont bien définis comme les seules voies pour le drainage lymphatique dans les pLN. Le suturing ces vaisseaux lymphatiques afferents peut sélectivement empêcher le flux lymphatique aux pLNs. Cette méthode permet d’interférer dans le flux lymphatique avec des dommages minimes aux cellules endothéliales lymphatiques dans le pLN drainant, les vaisseaux lymphatiques afferents, ainsi que d’autres vaisseaux lymphatiques autour de la région. Cette méthode a été utilisée pour étudier comment la lymphe affecte les venules endothéliales élevées (HEV) et l’expression de chimiokine dans le LN, et comment la lymphe coule par le tissu adipeux entourant le LN en l’absence des vaisseaux lymphatiques fonctionnels. Avec la reconnaissance croissante de l’importance de la fonction lymphatique, cette méthode aura des applications plus larges pour démêler davantage la fonction des vaisseaux lymphatiques dans la régulation du microenvironnement LN et des réponses immunitaires.

Introduction

L’organisation spatiale du système lymphatique fournit un soutien structurel et fonctionnel pour éliminer efficacement le liquide extracellulaire et transporter les antigènes et les cellules présentant des antigènes (APC) vers les LN drainants. Les vaisseaux lymphatiques initiaux (également appelés capillaires lymphatiques) sont hautement perméables en raison de leurs jonctions intercellulaires discontinues, qui facilitent la collecte efficace des fluides, des cellules et d’autres matériaux des espaces extracellulairesenvironnants 1. Les vaisseaux lymphatiques initiaux fusionnent dans la collecte des vaisseaux lymphatiques, qui ont des jonctions intercellulaires serrées, une membrane continue de sous-sol, et la couverture lymphatique de muscle. La collecte des vaisseaux lymphatiques sont responsables du transport de la lymphe recueillie vers les LN drainants et, éventuellement, le retour de la lymphe à la circulation2,3. Les vaisseaux lymphatiques de collecte qui propulsent la lymphe dans le LN drainant sont les vaisseaux lymphatiques afferents4,5,6,7. L’obstruction des vaisseaux lymphatiques afferents peut bloquer le flux lymphatique dans les LNs, qui est une technique utile lors de l’étude de la fonction du flux lymphatique.

Des études antérieures ont montré que le flux lymphatique joue un rôle important dans le transport des antigènes et des APC, ainsi que dans le maintien de l’homéostasie du LN. Il est bien entendu que les APC dérivés des tissus, généralement activés cellules dendritiques migration (CD), voyagent à travers les vaisseaux lymphatiques afferents vers le LN pour activer les lymphocytes T8. L’idée que les antigènes de forme libre, tels que les microbes ou les antigènes solubles, s’écoulent passivement avec la lymphe vers le LN pour activer les APC résidents de LN a gagné l’acceptation au cours dela dernière décennie 9,10,11,12. Les antigènes de forme libre voyageant avec la lymphe prennent quelques minutes après l’infection pour se rendre au LN, et l’activation cellulaire ln-résidente peut se produire dans les 20 minutes après la stimulation. C’est beaucoup plus rapide que l’activation des CD migrateurs, qui prend plus de 8 h pour entrer dans le LN9 drainant. En plus de transporter des antigènes pour initier la protection immunitaire, la lymphe transporte également des cytokines et des DCs au LN pour maintenir son microenvironnement, et pour soutenir l’homéostasie de cellulesimmunitaires 13,14. Auparavant, le blocage du flux lymphatique en suturant les vaisseaux lymphatiques afferents a démontré que la lymphe est nécessaire pour maintenir le phénotype HEV nécessaire pour soutenir la cellule T homéostatique et la cellule B homing à la LN15,16,17. CCL21 est une chimiokine critique qui dirige le positionnement des cellules DC et T dans le LN8,18. Le blocage du flux lymphatique interrompt l’expression du CCL21 dans le LN et interrompt potentiellement le positionnement et/ou l’interaction des cellules DC et T dans le LN19. Ainsi, le blocage du flux lymphatique peut abroger directement ou indirectement l’accès à l’antigène/DC au LN drainant en perturbant le microenvironnement LN qui régule les réponses immunitaires dans le LN. Pour mieux étudier la fonction du flux lymphatique, un protocole expérimental est présenté (figure 1) pour bloquer le flux lymphatique chez la souris en suturant les vaisseaux lymphatiques afferents du pied au pLN. Cette méthode peut être une technique importante pour de futures études sur la fonction lymphatique dans des conditions saines et maladies.

Protocol

Tous les travaux sur les animaux doivent être approuvés par le comité institutionnel et gouvernemental d’éthique et de manipulation des animaux.  C’est une opéra tion de non-survie. 1. Préparation des matériaux Préparer 100 mL d’éthanol à 70 % en mélangeant 70 mL d’éthanol à 100 % avec 30 mL d’eau stérile. Autoclave tous les outils chirurgicaux avant la chirurgie et garder les outils dans 70% d’éthanol avant et pendant la chirurgie pour maintenir la stéri…

Representative Results

Suture des vaisseaux lymphatiques a été utilisé dans les étudesprécédentes 15,16,17,19, où il a servi d’outil important pour étudier la fonction du flux lymphatique avant la biologie moléculaire des vaisseaux lymphatiques a été mieux compris. Le blocage du flux lymphatique interrompt l’homéostasie LN, ce qui conduit à hevs perdre l’expression génétique critique nécessaire …

Discussion

Le blocage du flux lymphatique aura de larges applications dans la manipulation de l’administration d’antigènes au LN dans des conditions saines et maladies. Il est possible d’utiliser cette méthode pour contrôler le moment de l’administration d’antigènes afin d’étudier comment le flux lymphatique continu régule la réponse immunitaire dans l’évacuation des LN. Cette méthode d’interruption du flux lymphatique peut également être utilisée pour étudier comment la lymphe influe sur la compartimen…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les auteurs remercient Ava Zardynezhad pour la relecture du manuscrit. Ces travaux sont appuyés par l’Institut canadien de recherche en santé (IRSC, PJT-156035), la Fondation canadienne pour l’innovation pour la SL (32930) et la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine pour Yujia Lin (81901576).

Materials

0.9% Sodium Chloride Saline Baxter JB1323
100% ethanol Greenfield Global University of Calgary distribution services UN1170.
Depilatory cream Nair Nair Sensitive Formula Hair Removal Crème with Sweet Almond Oil and Baby Oil, 200-ml. Or similar product.
Evans Blue dye Sigma Life Science E2129-10G For 1 ml of Evans blue dye, add 0.1g Evans blue to 10 ml PBS. The Evens Blue solution will be filtered through 0.22 mm filters and kept sterile in 1ml aliquots.
Fluorescein isothiocyanate isomer I (FITC) Sigma Life Science F7250-1G
Forceps Dumont #3 WPI 500337
Forceps Dumont #5 WPI 500233
Injection apparatus Connect one end of polyethylene tubing to 30G × ½ needle. Attach a 1ml TB syringe to the needle. Dislodge needle shaft from another 30G × ½ needle. Insert the blunt end of the 30G × ½ needle shaft into the other end of the tubing. The inside diameter of this tubing is 0.28mm. Thus, 1.6 cm of fluid in the tubing is 1 μl.
Insulin syringe Becton Dickinson and Company (BD) 329461
IRIS Forcep straight WPI 15914
IRIS scissors WPI 14218-G
Ketamine Narketan DIN 02374994 The suppliers of Ketamine and Xylazine are usually under institutional and governmental regulation.
Needles (26Gx3/8) Becton Dickinson and Company (BD) 305110
Needles (30Gx1/2) Becton Dickinson and Company (BD) 305106
Paton Needle Holder ROBOZ RS6403 Straight, Without Lock; Serrated
Phosphate-Buffered Saline (PBS) Sigma Life Science P4417-100TAB
Polyethylene tubing Becton Dickinson and Company (BD) 427401
Surgical tape (1.25cmx9.1m ) Transpore 1527-0
Surgical tape (2.5cmx9.1m ) Transpore 1527-1
Suture Davis and Geck CYANAMID Canada 11/04 0.7 metric monofilament polypropylene
Syringe (1ml) Becton Dickinson and Company (BD) 309659
VANNAS scissors World Precision Instruments (WPI) 14122-G
Xylazine Rompun DIN02169606 The suppliers of Ketamine and Xylazine are usually under institutional and governmental regulation.
Equipment
Dissecting microscope Olympus Olympus S261 (522-STS OH141791) with light source: Olympus Highlight 3100
Confocal microscope Leica SP8

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Cite This Article
Lin, Y., Xue, J., Liao, S. Blocking Lymph Flow by Suturing Afferent Lymphatic Vessels in Mice. J. Vis. Exp. (159), e61178, doi:10.3791/61178 (2020).

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