マウスの不感性リンパ管を縫合することによりリンパ流を遮断する
Summary
尿管性リンパ管の外科的縫合によってリンパの流れを遮断するプロトコルが提示される。
Abstract
リンパ管は、組織液バランスを維持し、抗原、サイトカイン、細胞をリンパ節(LNs)に輸送することで免疫保護を最適化する上で重要です。リンパ管の機能を研究する際のリンパ流の中断は重要な方法である。マウスフットパッドからポピトリリンパ節(pRN)までの不浸透性リンパ管は、リンパがpRNに排出される唯一の経路として明確に定義されている。これらの不透過性リンパ管を縫合すると、リンパのリンパ流を選択的に防ぐことができます。この方法は、排水pLN、気泡性リンパ管、ならびに領域の周りの他のリンパ管におけるリンパ内皮細胞への損傷を最小限に抑えてリンパ流の干渉を可能にする。この方法は、LNにおける高内皮小胞(HEV)およびケモカイン発現にリンパ管がどのように影響し、機能的なリンパ管がない場合にLNを取り巻く脂肪組織をリンパがどのように流れるかを研究するために使用されてきた。リンパ機能の重要性の認識が高まる中、この方法は、LN微小環境および免疫応答を調節するリンパ管の機能をさらに解明するためのより広範な応用を有するであろう。
Introduction
リンパ系の空間組織は、細胞外液を効率的に除去し、抗原および抗原提示細胞(APC)を排出するLNsに輸送するための構造的および機能的なサポートを提供する。初期リンパ管(リンパ管管とも呼ばれる)は、細胞間の不連続な接合により透過性が高く、周囲の細胞外空間から液体、細胞、および他の物質を効果的に収集しやすくする1。最初のリンパ管は、細胞間の接合が緊密で、連続的な基盤膜、リンパ筋のカバレッジを有するリンパ管を採取する。リンパ管の採取は、採取したリンパを排水中のLUNに輸送し、最終的にリンパを循環2,3に戻す役割を担う。リンパを排水LNに推進する集水性リンパ管は、不発泡リンパ管4、5、6、7である。発泡性リンパ管の閉塞は、リンパ流の機能を研究する際に有用な技術であるLNsへのリンパ流を遮断する可能性がある。
これまでの研究では、リンパ流は抗原およびAPCを輸送するだけでなく、LN恒常性を維持する上で重要な役割を果たしていることを示している。組織由来のAPCは、典型的には活性化された回遊樹状細胞(DC)が、不透過性リンパ管を通過してLNに移動し、T細胞8を活性化することがよく理解されている。微生物や可溶性抗原などの自由形抗原が、LNにリンパを持って受動的に流れ、LN居住APcを活性化するという考え方は、過去10年間で9、10、11、12で受け入れられています。リンパを伴って移動する自由形抗原は、感染後数分でLNに移動し、LN常駐細胞活性化は刺激後20分以内に起こり得る。これは、ドレイン LN9に入るのに 8 時間以上かかる DC の移行のアクティブ化よりもはるかに高速です。免疫保護を開始するために抗原を輸送することに加えて、リンパはまた、その微小環境を維持するためにサイトカインおよびDCをLNに運び、免疫細胞恒常性13、14をサポートする。以前は、アフェレントリンパ管を縫合することによりリンパ流を遮断し、LN15、16、17にホメオスタティックT細胞およびB細胞ホーミングをサポートするために必要なHEV表現型を維持するために必要なリンパが必要であることを実証した。CCL21は、LN8、18におけるDCおよびT細胞の位置を指示する重要なケモカインである。リンパ流を遮断すると、LNにおけるCCL21発現が中断し、LN19におけるDCおよびT細胞の位置決めおよび/または相互作用を中断する可能性がある。したがって、リンパ流を遮断すると、LN内の免疫応答を調節するLN微小環境を破壊することによって、抗原/DCのドレインLNへの直接または間接的なアクセスを遮断することができる。リンパ流の機能をより的調するために、フットパッドからpLNに対して、マウスのリンパ流を遮断する実験プロトコル(図1)を提示する。この方法は、健康で病気の状態でリンパ機能に関する将来の研究のための重要な技術となり得る。
Protocol
Representative Results
Discussion
リンパ流を遮断することは、健康で病気の状態でLNへの抗原送達を操作する広範な用途を有するであろう。この方法を用い、連続リンパ流がリンゲンの流出における免疫応答を調節する方法を研究するために、抗原送達のタイミングを制御することができる。リンパ流中断のこの方法は、リンパがLNにおける細胞区画化、細胞活性化、細胞移動、および細胞間相互作用に与える影響を研究する…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、原稿の校正をアヴァ・ザルディネズハドに感謝する。この研究は、カナダ保健研究所(CIHR、PJT-156035)、カナダSLイノベーション財団(32930)、中国国立自然科学財団(81901576)によって支援されています。
Materials
| 0.9% Sodium Chloride Saline | Baxter | JB1323 | |
| 100% ethanol | Greenfield Global | University of Calgary distribution services UN1170. | |
| Depilatory cream | Nair | Nair Sensitive Formula Hair Removal Crème with Sweet Almond Oil and Baby Oil, 200-ml. Or similar product. | |
| Evans Blue dye | Sigma Life Science | E2129-10G | For 1 ml of Evans blue dye, add 0.1g Evans blue to 10 ml PBS. The Evens Blue solution will be filtered through 0.22 mm filters and kept sterile in 1ml aliquots. |
| Fluorescein isothiocyanate isomer I (FITC) | Sigma Life Science | F7250-1G | |
| Forceps Dumont #3 | WPI | 500337 | |
| Forceps Dumont #5 | WPI | 500233 | |
| Injection apparatus | Connect one end of polyethylene tubing to 30G × ½ needle. Attach a 1ml TB syringe to the needle. Dislodge needle shaft from another 30G × ½ needle. Insert the blunt end of the 30G × ½ needle shaft into the other end of the tubing. The inside diameter of this tubing is 0.28mm. Thus, 1.6 cm of fluid in the tubing is 1 μl. | ||
| Insulin syringe | Becton Dickinson and Company (BD) | 329461 | |
| IRIS Forcep straight | WPI | 15914 | |
| IRIS scissors | WPI | 14218-G | |
| Ketamine | Narketan | DIN 02374994 | The suppliers of Ketamine and Xylazine are usually under institutional and governmental regulation. |
| Needles (26Gx3/8) | Becton Dickinson and Company (BD) | 305110 | |
| Needles (30Gx1/2) | Becton Dickinson and Company (BD) | 305106 | |
| Paton Needle Holder | ROBOZ | RS6403 | Straight, Without Lock; Serrated |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Sigma Life Science | P4417-100TAB | |
| Polyethylene tubing | Becton Dickinson and Company (BD) | 427401 | |
| Surgical tape (1.25cmx9.1m ) | Transpore | 1527-0 | |
| Surgical tape (2.5cmx9.1m ) | Transpore | 1527-1 | |
| Suture | Davis and Geck CYANAMID Canada | 11/04 | 0.7 metric monofilament polypropylene |
| Syringe (1ml) | Becton Dickinson and Company (BD) | 309659 | |
| VANNAS scissors | World Precision Instruments (WPI) | 14122-G | |
| Xylazine | Rompun | DIN02169606 | The suppliers of Ketamine and Xylazine are usually under institutional and governmental regulation. |
| Equipment | |||
| Dissecting microscope | Olympus | Olympus S261 (522-STS OH141791) with light source: Olympus Highlight 3100 | |
| Confocal microscope | Leica | SP8 |
References
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