Modelo de inoculación de la almohadilla del ratón para estudiar las respuestas neuroinflamatorias inducidas por el viral
Summary
El modelo de inoculación de la almohadilla es una herramienta valiosa para caracterizar las respuestas neuroinflamatorias inducidas por virus in vivo. En particular, proporciona una evaluación clara de la cinética viral y los procesos inmunopatológicos asociados iniciados en el sistema nervioso periférico.
Abstract
Este protocolo describe un modelo de inoculación de la almohadilla para pies utilizado para estudiar el inicio y desarrollo de respuestas neuroinflamatorias durante la infección por alfaherpesvirus en ratones. Como los alfaherpesvirus son los principales invasores del sistema nervioso periférico (PNS), este modelo es adecuado para caracterizar la cinética de la replicación viral, su propagación desde el PNS al SNC, y las respuestas neuroinflamatorias asociadas. El modelo de inoculación de la almohadilla de pie permite que las partículas del virus se propaguen desde un sitio de infección primaria en la epidermis del pie a las fibras nerviosas sensoriales y simpáticas que invaden la epidermis, las glándulas sudoríparas y la dermis. La infección se propaga a través del nervio ciático a los ganglios de la raíz dorsal (DRG) y, en última instancia, a través de la médula espinal hasta el cerebro. Aquí, se inocula un reposapiés de ratón con el virus pseudorabies (PRV), un alfaherpesvirus estrechamente relacionado con el virus del herpes simple (VHS) y el virus de la varicela-zoster (VZV). Este modelo demuestra que la infección por PRV induce una inflamación grave, caracterizada por la infiltración de neutrófilos en el reposapiés y el DRG. Las altas concentraciones de citoquinas inflamatorias son posteriormente detectadas en tejidos homogeneizados por ELISA. Además, se observa una fuerte correlación entre el gen PRV y la expresión de proteínas (a través de la tinción qPCR e IF) en DRG y la producción de citoquinas proinflamatorias. Por lo tanto, el modelo de inoculación de la almohadilla de pie proporciona una mejor comprensión de los procesos subyacentes a las neuropatías inducidas por alfaherpesvirus y puede conducir al desarrollo de estrategias terapéuticas innovadoras. Además, el modelo puede guiar la investigación sobre neuropatías periféricas, como la esclerosis múltiple y el daño inducido por el virus asociado al PNS. En última instancia, puede servir como una herramienta in vivo rentable para el desarrollo de fármacos.
Introduction
Este estudio describe un modelo de inoculación de la almohadilla para investigar la replicación y propagación de virus desde el PNS al SNC y las respuestas neuroinflamatorias asociadas. El modelo de inoculación de la almohadilla de pie se ha utilizado intensamente para estudiar la infección por alfaherpesvirus en las neuronas1,2,3. El objetivo principal de este modelo es permitir que los virus neurotrópicos viajen una distancia máxima a través del PNS antes de alcanzar el SNC. Aquí, este modelo se utiliza para obtener nuevos conocimientos en el desarrollo de una neuropatía particular (picazón neuropática) en ratones infectados con el virus pseudorabies (PRV).
El PRV es un alfaherpesvirus relacionado con varios patógenos conocidos (es decir, herpes simple tipo 1 y 2 [HSV1 y HSV2] y virus varicela-zoster [VZV]), que causan herpes labial, lesiones genitales y varicela, respectivamente4. Estos virus son todos pantrópicos y capaces de infectar muchos tipos de células diferentes sin mostrar afinidad por un tipo de tejido específico. Sin embargo, todos ellos exhiben un neurotropismo característico al invadir el PNS (y ocasionalmente, el SNC) de especies anfitrionas. El huésped natural es el cerdo, pero el PRV puede infectar a la mayoría de los mamíferos. En estos huéspedes no naturales, PRV infecta el PNS e induce un prurito severo llamado la “prurito loco”, seguido de la muerte peraguta5,6. El papel de la respuesta neuroinmune en el resultado clínico y la patogénesis de la infección por PRV ha sido mal entendido.
El modelo de inoculación de la almohadilla de pie permite que el PRV inicie la infección en las células epidérmicas de la almohadilla. Luego, la infección se propaga a las fibras nerviosas sensoriales y simpáticas que inerpen la epidermis, las glándulas sudoríparas y la dermis. La infección se propaga por partículas de virus que se mueven a través del nervio ciático al DRG dentro de aproximadamente 60 h. La infección se propaga a través de la médula espinal, llegando en última instancia al cerebro trasero cuando los animales se vuelven moribundos (82 h después de la infección). Durante este período de tiempo, las muestras de tejido se pueden recoger, procesar y analizar para la replicación del virus y los marcadores de la respuesta inmunitaria. Por ejemplo, el examen histológico y la cuantificación de la carga viral se pueden realizar en diferentes tejidos para establecer correlaciones entre la iniciación y el desarrollo de procesos clínicos, virológicos y neuroinflamatorios en la patogénesis del V PRV.
Utilizando el modelo de inoculación de la almohadilla, se pueden investigar los mecanismos celulares y moleculares del prurito inducido por PRV en ratones. Además, este modelo puede proporcionar una nueva visión de la iniciación y el desarrollo de la neuroinflamación inducida por el virus durante las infecciones por herpesvirus. Una mejor comprensión de los procesos subyacentes a las neuropatías inducidas por alfaherpesvirus puede conducir al desarrollo de estrategias terapéuticas innovadoras. Por ejemplo, este modelo es útil para investigar los mecanismos de la picazón neuropática en pacientes con lesiones post-herpéticas (por ejemplo, herpes zóster, herpes zóster) y probar nuevas dianas terapéuticas en ratones para las enfermedades humanas correspondientes.
Protocol
Representative Results
Discussion
El modelo de inoculación de la almohadilla de pie descrito aquí es útil para investigar el inicio y desarrollo de respuestas neuroinflamatorias durante la infección por alfaherpesvirus. Además, este modelo in vivo se utiliza para establecer la cinética de la replicación y propagación del alfaherpesvirus desde el PNS al SNC. Se trata de un suplente de otros modelos de inoculación, como el modelo de inoculación de la piel del flanco, que se basa en el rascado dérmico profundo13,o la ruta …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores reconocen a los laboratorios de Charles River por su excelente apoyo técnico en la ejecución de los análisis de histopatología. Este trabajo fue financiado por el Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares (NINDS) (RO1 NS033506 y RO1 NS060699). Los financiadores no tenían ningún papel en el diseño de estudios, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.
Materials
| Antibody anti-PRV gB | Made by the lab | 1/500 dilution | |
| Aqua-hold2 pap pen red | Fisher scientific | 2886909 | |
| Compact emery boards-24 count (100/180 grit nail files) | Revlon | ||
| Complete EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | 11836170001 | |
| C57BL/6 mice (5-7 weeks) | The Jackson Laboratories | ||
| DAPI solution (1mg/ml) | Fisher scientific | 62248 | 1/1000 dilution |
| Disposable sterile polystyrene petri dish 100 x 15 mm | Sigma-Aldrich | P5731500 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Hyclone, GE Healthcare life Sciences | SH30022 | |
| Dulbecco's Phophate Buffer Saline (PBS) solution | Hyclone, GE Healthcare life Sciences | SH30028 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone, GE Healthcare life Sciences | SH30088 | |
| Fine curved scissors stainless steel | FST | 14095-11 | |
| Fluoromount-G mounting media | Fisher scientific | 0100-01 | |
| Formalin solution, neutral buffered 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Isothesia Isoflurane | Henry Schein | NDC 11695-6776-2 | |
| Microcentrifuge tube 2ml | Denville Scientific | 1000945 | |
| Microtube 1.5ml | SARSTEDT | 72692005 | |
| Negative goat serum | Vector | S-1000 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 154022 | |
| Precision Glide needle 18G | BD | 305196 | |
| Razor blades steel back | Personna | 9412071 | |
| RNA lysis buffer (RLT) | Qiagen | 79216 | |
| Stainless Steel Beads, 5 mm | Qiagen | 69989 | |
| Superfrost/plus microscopic slides | Fisher scientific | 12-550-15 | |
| Tissue lyser LT | Qiagen | 69980 | |
| Tissue-Tek OCT | Sakura | 4583 | |
| 488 (goat anti-mouse) | Life Technologies | A11029 | 1/2000 dilution |
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