Summary

Mouse Footpad Modello di inoculazione per studiare risposte neuroinfiammatorie indotte da virus

Published: June 14, 2020
doi:

Summary

Il modello di inoculazione del footpad è uno strumento prezioso per caratterizzare le risposte neuroinfiammatorie indotte da virali in vivo. In particolare, fornisce una valutazione chiara della cinetica virale e dei processi immunopatologici associati avviati nel sistema nervoso periferico.

Abstract

Questo protocollo descrive un modello di inoculazione del footpad utilizzato per studiare l’avvio e lo sviluppo di risposte neuroinfiammatorie durante l’infezione da alfaherpesvirus nei topi. Poiché gli alfaherppi sono i principali invasori del sistema nervoso periferico (PNS), questo modello è adatto a caratterizzare la cinetica della replicazione virale, la sua diffusione dal PNS al SNC e le risposte neuroinfiammatorie associate. Il modello di inoculazione del footpad consente alle particelle di virus di diffondersi da un sito di infezione primaria nell’epidermide del footpad alle fibre nervose sensoriali e simpatiche che innervano l’epidermide, le ghiandole sudoripare e la dermide. L’infezione si diffonde attraverso il nervo sciatico ai gangli della radice dorsale (DRG) e, infine, attraverso il midollo spinale al cervello. Qui, un piede di topo è inoculato con pseudorabies virus (PRV), un virus alfaherpesvirus strettamente correlato al virus dell’herpes simplex (HSV) e del virus varicella-zoster . Questo modello dimostra che l’infezione da PRV induce una grave infiammazione, caratterizzata da infiltrazione di neutrofili nel footpad e DRG. Alte concentrazioni di citochine infiammatorie vengono successivamente rilevate nei tessuti omogeneizzati da ELISA. Inoltre, si osserva una forte correlazione tra l’espressione genica e proteica PRV (tramite qPCR e colorazione IF) nella DRG e la produzione di citochine pro-infiammatorie. Pertanto, il modello di inoculazione del footpad fornisce una migliore comprensione dei processi alla base delle neuropatie indotte da alfaancorato e può portare allo sviluppo di strategie terapeutiche innovative. Inoltre, il modello può guidare la ricerca sulle neuropatie periferiche, come la sclerosi multipla e il danno ai virali associato al PNS. In definitiva, può servire come uno strumento in vivo conveniente per lo sviluppo di farmaci.

Introduction

Questo studio descrive un modello di inoculazione del footpad per studiare la replica e la diffusione dei virus dal PNS al SNC e le risposte neuroinfiammatorie associate. Il modello di inoculazione del footpad è stato utilizzato intensamente per studiare l’infezione da alfaherpesvirus nei neuroni1,2,3. L’obiettivo principale di questo modello è quello di consentire ai virus neurotropici di percorrere una distanza massima attraverso il PNS prima di raggiungere il SNC. Qui, questo modello viene utilizzato per ottenere nuove intuizioni nello sviluppo di un particolare neuropatia (prurito neuropatico) in topi infettati da pseudorabies virus (PRV).

Il PRV è un alfaintovirus correlato a diversi patogeni ben noti (cioè herpes simplex di tipo 1 e 2 [HSV1 e HSV2] e virus varicella-zoster [VV]), che causano herpivi di freddo, lesioni genitali e varicella, rispettivamente4. Questi virus sono tutti pantropici e in grado di infettare molti diversi tipi di cellule senza mostrare affinità per un tipo di tessuto specifico. Tuttavia, tutti presentano un caratteristico neurotropismo invadendo il PNS (e occasionalmente, il CNS) delle specie ospiti. L’ospite naturale è il maiale, ma il PRV può infettare la maggior parte dei mammiferi. In questi ospiti non naturali, PRV infetta il PNS e induce un forte prurito chiamato “prurito pazzo”, seguito da morte peracuta5,6. Il ruolo della risposta neuroimmune nell’esito clinico e nella patogenesi dell’infezione da PRV è stato poco compreso.

Il modello di inoculazione del footpad consente a PRV di avviare l’infezione nelle cellule epidermiche del footpad. Quindi, l’infezione si diffonde in fibre nervose sensoriali e simpatiche che innervano l’epidermide, le ghiandole sudoripare e il derma. L’infezione si diffonde da particelle di virus che si muovono attraverso il nervo sciatico al DRG entro circa 60 h. L’infezione si diffonde attraverso il midollo spinale, raggiungendo infine il cervello posteriore quando gli animali diventano moribondi (82 h dopo l’infezione). Durante questa finestra temporale, i campioni di tessuto possono essere raccolti, elaborati e analizzati per la replicazione del virus e marcatori della risposta immunitaria. Ad esempio, l’esame istologico e la quantificazione del carico virale possono essere eseguiti in diversi tessuti per stabilire correlazioni tra l’avvio e lo sviluppo di processi clinici, virologici e nevrinfiammatori nella patogenesi PRV.

Utilizzando il modello di inoculazione del pedebole, è possibile studiare i meccanismi cellulari e molecolari del prurito indotta da PRV nei topi. Inoltre, questo modello può fornire nuove informazioni sull’avvio e lo sviluppo di neuroinfiammazioni indotte da virus durante le infezioni da herpesvirus. Una migliore comprensione dei processi alla base delle neuropatie indotte dall’alfadante può portare allo sviluppo di strategie terapeutiche innovative. Ad esempio, questo modello è utile per studiare i meccanismi del prurito neuropatico nei pazienti con lesioni post-epetiche (ad esempio, herpes zoster, heringles) e testare nuovi bersagli terapeutici nei topi per le corrispondenti malattie umane.

Protocol

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati effettuati in conformità a un protocollo (numero 2083-16 e 2083-19) esaminato e approvato dal Comitato per la cura e l’uso degli animali dell’Istituzione (IACUC) dell’Università di Princeton. Questo lavoro è stato fatto seguendo rigorosamente i requisiti di livello di biosicurezza-2 (BSL-2), a cui abbiamo un laboratorio completamente attrezzato approvato dal comitato per la biosicurezza dell’Università di Princeton. Le procedure, tra cui l’abrasione del piede del topo, l…

Representative Results

Il modello di inoculazione del piede del mouse consente la caratterizzazione dell’immunopatogenesi dell’infezione da alfarevirus in vivo, compresa la replicazione e la diffusione dell’infezione dal footpad inoculato al sistema nervoso e l’induzione di specifiche risposte neuroinfiammatorie. In questo studio, abbiamo prima abraso il piede posteriore del topo e sia finto-inoculato o inoculato la regione abrasa con un ceppo virulento di PRV (PRV-Becker). Il sito di abrasione era visibile nella pe…

Discussion

Il modello di inoculazione del footpad descritto qui è utile per studiare l’avvio e lo sviluppo di risposte neuroinfiammatorie durante l’infezione da alfaherpesvirus. Inoltre, questo modello in vivo viene utilizzato per stabilire la cinetica della replicazione e la diffusione di alfaherpesvirus dal PNS al SNC. Si tratta di un’alternativa ad altri modelli di inoculazione, come il modello di inoculazione della pelle del fianco, che si basa su graffi dermici profondi13, o il percorso intracranico, c…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori riconoscono i laboratori Charles River per il loro eccellente supporto tecnico nell’esecuzione delle analisi istopatologiche. Questo lavoro è stato finanziato dal National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) (RO1 NS033506 e RO1 NS060699). I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio, nella raccolta e nell’analisi dei dati, nella decisione di pubblicazione o nella preparazione del manoscritto.

Materials

Antibody anti-PRV gB Made by the lab 1/500 dilution
Aqua-hold2 pap pen red Fisher scientific 2886909
Compact emery boards-24 count (100/180 grit nail files) Revlon
Complete EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Sigma-Aldrich 11836170001
C57BL/6 mice (5-7 weeks) The Jackson Laboratories
DAPI solution (1mg/ml) Fisher scientific 62248 1/1000 dilution
Disposable sterile polystyrene petri dish 100 x 15 mm Sigma-Aldrich P5731500
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Hyclone, GE Healthcare life Sciences SH30022
Dulbecco's Phophate Buffer Saline (PBS) solution Hyclone, GE Healthcare life Sciences SH30028
Fetal bovine serum (FBS) Hyclone, GE Healthcare life Sciences SH30088
Fine curved scissors stainless steel FST 14095-11
Fluoromount-G mounting media Fisher scientific 0100-01
Formalin solution, neutral buffered 10% Sigma-Aldrich HT501128
Isothesia Isoflurane Henry Schein NDC 11695-6776-2
Microcentrifuge tube 2ml Denville Scientific 1000945
Microtube 1.5ml SARSTEDT 72692005
Negative goat serum Vector S-1000
Penicillin/Streptomycin Gibco 154022
Precision Glide needle 18G BD 305196
Razor blades steel back Personna 9412071
RNA lysis buffer (RLT) Qiagen 79216
Stainless Steel Beads, 5 mm Qiagen 69989
Superfrost/plus microscopic slides Fisher scientific 12-550-15
Tissue lyser LT Qiagen 69980
Tissue-Tek OCT Sakura 4583
488 (goat anti-mouse) Life Technologies A11029 1/2000 dilution

References

  1. Field, H. J., Hill, T. J. The pathogenesis of pseudorabies in mice following peripheral inoculation. Journal of General Virology. 23 (2), 145-157 (1974).
  2. Engel, J. P., Madigan, T. C., Peterson, G. M. The transneuronal spread phenotype of herpes simplex virus type 1 infection of the mouse hind footpad. Journal of Virology. 71 (3), 2425-2435 (1997).
  3. Guedon, J. M., et al. Neuronal changes induced by Varicella Zoster Virus in a rat model of postherpetic neuralgia. Virology. 482, 167-180 (2015).
  4. Pomeranz, L. E., Reynolds, A. E., Hengartner, C. J. Molecular biology of pseudorabies virus: impact on neurovirology and veterinary medicine. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 69 (3), 462-500 (2005).
  5. Wittmann, G., Rziha, H. J., Knipe, D. M., Howley, P. M. Aujeszky’s disease (pseudorabies) in pigs. Herpesvirus diseases of cattle, horses and pigs. 9, 230-325 (1989).
  6. Leman, A. D., Glock, R. D., Mengeling, W. L., Penny, R. H. C., Scholl, E., Straw, B. . Diseases of swine, 6th ed. , 209-223 (1986).
  7. Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia. BMC Research Notes. 9, 82 (2016).
  8. Sands, S. A., Leung-Toung, R., Wang, Y., Connelly, J., LeVine, S. M. Enhanced Histochemical Detection of Iron in Paraffin Sections of Mouse Central Nervous System Tissue: Application in the APP/PS1 Mouse Model of Alzheimer’s Disease. ASN Neuro. 8 (5), (2016).
  9. Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. Manual hematoxylin and eosin staining of mouse tissue sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (6), 655-658 (2014).
  10. Koyuncu, O. O., MacGibeny, M. A., Hogue, I. B., Enquist, L. W. Compartmented neuronal cultures reveal two distinct mechanisms for alpha herpesvirus escape from genome silencing. PLoS pathogens. 13 (10), 1006608 (2017).
  11. Laval, K., Vernejoul, J. B., Van Cleemput, J., Koyuncu, O. O., Enquist, L. W. Virulent Pseudorabies Virus Infection Induces a Specific and Lethal Systemic Inflammatory Response in Mice. Journal of Virology. 92 (24), 01614-01618 (2018).
  12. Laval, K., Van Cleemput, J., Vernejoul, J. B., Enquist, L. W. Alphaherpesvirus infection of mice primes PNS neurons to an inflammatory state regulated by TLR2 and type I IFN signaling. PLoS Pathogens. 15 (11), 1008087 (2019).
  13. Brittle, E. E., Reynolds, A. E., Enquist, L. W. Two modes of pseudorabies virus neuroinvasion and lethality in mice. Journal of Virology. 78 (23), 12951-12963 (2004).
  14. Mancini, M., Vidal, S. M. Insights into the pathogenesis of herpes simplex encephalitis from mouse models. Mammalian Genome: Official Journal of the International Mammalian Genome Society. 29 (7-8), 425-445 (2018).
  15. Kopp, S. J., et al. Infection of neurons and encephalitis after intracranial inoculation of herpes simplex virus requires the entry receptor nectin-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (42), 17916-17920 (2009).
  16. Wang, J. P., et al. Role of specific innate immune responses in herpes simplex virus infection of the central nervous system. Journal of Virology. 86 (4), 2273-2281 (2012).
  17. Haberthur, K., Messaoudi, I. Animal models of varicella zoster virus infection. Pathogens. 2 (2), 364-382 (2013).
  18. Sarova-Pinhas, I., Achiron, A., Gilad, R., Lampl, Y. Peripheral neuropathy in multiple sclerosis: a clinical and electrophysiologic study. Acta Neurologica Scandinavia. 91 (4), 234-238 (1995).
  19. MacGibeny, M. A., Koyuncu, O. O., Wirblich, C., Schnell, M. J., Enquist, L. W. Retrograde axonal transport of rabies virus is unaffected by interferon treatment but blocked by emetine locally in axons. PLoS Pathogens. 14 (7), 1007188 (2018).
  20. Hunsperger, E. A., Roehrig, J. T. Temporal analyses of the neuropathogenesis of a West Nile virus infection in mice. Journal of Neurovirology. 12 (2), 129-139 (2006).
  21. Swartwout, B. K., et al. Zika Virus Persistently and Productively Infects Primary Adult Sensory Neurons In Vitro. Pathogens. 6 (4), 49 (2017).
  22. Racaniello, V. R. One hundred years of poliovirus pathogenesis. Virology. 344 (1), 9-16 (2006).

Play Video

Cite This Article
Laval, K., Maturana, C. J., Enquist, L. W. Mouse Footpad Inoculation Model to Study Viral-Induced Neuroinflammatory Responses. J. Vis. Exp. (160), e61121, doi:10.3791/61121 (2020).

View Video