Мышь Footpad прививки Модель для изучения вирусно-индуцированных нейровоспалительных реакций
Summary
Модель прививки стопы является ценным инструментом для характеристики вирусных индуцированных нейровоспалительных реакций в vivo. В частности, он обеспечивает четкую оценку вирусной кинетики и связанных с ней иммунопатологических процессов, инициированных в периферической нервной системе.
Abstract
Этот протокол описывает модель прививки, используемой для изучения инициации и развития нейровоспалительных реакций во время альфагерпепсвирусной инфекции у мышей. Поскольку альфагерпексвирусы являются основными захватчиками периферической нервной системы (PNS), эта модель подходит для характеристики кинетики вирусной репликации, ее распространения от PNS к ЦНС и связанных с ними нейровоспалительных реакций. Модель прививки стопы позволяет частицам вируса распространяться от первичного места инфекции в footpad эпидермис к сенсорным и симпатическим нервным волокнам, которые иннервировать эпидермис, потовые железы и дерму. Инфекция распространяется через седалищный нерв к спинной корневой ганглии (DRG) и в конечном итоге через спинной мозг к мозгу. Здесь, мышь footpad прививается с вирусом pseudorabies (PRV), альфагерпезвирус тесно связаны с вирусом простого герпеса (HSV) и вирус ветряной опоясывающий лишай (ВЗВ). Эта модель показывает, что PRV инфекция вызывает сильное воспаление, характеризуется инфильтрацией нейтрофила в подножку и DRG. Высокие концентрации воспалительных цитокинов впоследствии обнаруживаются в гомогенизированных тканях ELISA. Кроме того, наблюдается сильная корреляция между геном PRV и экспрессией белка (через qPCR и IF окрашивания) в DRG и производством провоспалительных цитокинов. Таким образом, модель прививки стопы обеспечивает лучшее понимание процессов, лежащих в основе нейропатий, вызванных альфагерпейвирусом, и может привести к разработке инновационных терапевтических стратегий. Кроме того, модель может направлять исследования на периферических невропатий, таких как рассеянный склероз и связанные с ними вирусные индуцированных повреждений PNS. В конечном счете, он может служить экономически эффективным инструментом in vivo для разработки лекарств.
Introduction
Это исследование описывает модель прививки для исследования репликации и распространения вирусов от PNS до ЦНС и связанных с ними нейровоспалительных реакций. Модель прививки стопы интенсивно используется для изучения альфагерпейвирусной инфекции в нейронах1,,2,,3. Основная цель этой модели заключается в том, чтобы позволить нейротропных вирусов путешествовать максимальное расстояние через PNS до достижения ЦНС. Здесь эта модель используется для получения новых идей в развитии конкретной невропатии (нейропатический зуд) у мышей, инфицированных вирусом псевдораби (PRV).
PRV является альфагерпезвирус, связанный с несколькими известными патогенами (на самом деле, герпес симокс типа 1 и 2 “HSV1 и HSV2” и вирус ветряной опоясывающий лишая, которые вызывают герпес, половые язвы, и ветряная оспа, соответственно4. Эти вирусы все пантропные и в состоянии заразить много различных типов клеток, не показывая сродство к определенному типу ткани. Тем не менее, все они проявляют характерный нейротропизм, вторгаясь в PNS (а иногда и ЦНС) видов-хозяев. Естественным хозяином является свинья, но PRV может заразить большинство млекопитающих. В этих не-естественных хостов, PRV заражает PNS и вызывает тяжелые зуд называется “безумный зуд”, а затем peracute смерти5,6. Роль нейроиммуна в клиническом исходе и патогенезе PRV инфекции было плохо изучено.
Модель прививки стопы позволяет PRV инициировать инфекцию в эпидермальных клетках стопы. Затем инфекция распространяется на сенсорные и симпатические нервные волокна, которые иннервирует эпидермис, потовые железы и дерму. Инфекция распространяется частицами вируса, движущимися через седалищный нерв к DRG в пределах приблизительно 60 ч. Инфекция распространяется через спинной мозг, в конечном счете, достигнув заднего мозга, когда животные становятся умирающими (82 ч после инфекции). В течение этого времени, образцы тканей могут быть собраны, обработаны и проанализированы для репликации вируса и маркеры иммунного ответа. Например, гистологическое обследование и количественная оценка вирусной нагрузки могут быть выполнены в различных тканях для установления корреляции между началом и развитием клинических, вирусологических и нейровоспалительных процессов в ВОЗ ПАТОГЕНеза PRV.
Используя модель прививки стопы, можно исследовать клеточные и молекулярные механизмы PRV-индуцированного зуда у мышей. Кроме того, эта модель может дать новое представление о начале и развитии вирус-индуцированной нейровоспламеняющиеся во время герпесвирусных инфекций. Более глубокое понимание процессов, лежащих в основе нейропатий, вызванных альфагерпейвирусом, может привести к разработке инновационных терапевтических стратегий. Например, эта модель полезна для исследования механизмов невропатического зуда у пациентов с пост-герпетическими поражениями (например, опоясывающим герпесом, черепицей) и тестирует новые терапевтические цели у мышей на соответствующие заболевания человека.
Protocol
Representative Results
Discussion
Модель прививки, описанная здесь, полезна для исследования инициирования и развития нейровоспалительных реакций во время альфагерпейвирусной инфекции. Кроме того, эта модель in vivo используется для установления кинетики репликации и распространения альфагерпезвируса от PNS до ЦНС. Это ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы признают лаборатории Реки Чарльза за их отличную техническую поддержку выполнения гистопатологических анализов. Эта работа была профинансирована Национальным институтом неврологических расстройств и инсульта (NINDS) (RO1 NS033506 и RO1 NS060699). Спонсоры не имели никакой роли в разработке и анализе исследований, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.
Materials
| Antibody anti-PRV gB | Made by the lab | 1/500 dilution | |
| Aqua-hold2 pap pen red | Fisher scientific | 2886909 | |
| Compact emery boards-24 count (100/180 grit nail files) | Revlon | ||
| Complete EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | 11836170001 | |
| C57BL/6 mice (5-7 weeks) | The Jackson Laboratories | ||
| DAPI solution (1mg/ml) | Fisher scientific | 62248 | 1/1000 dilution |
| Disposable sterile polystyrene petri dish 100 x 15 mm | Sigma-Aldrich | P5731500 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Hyclone, GE Healthcare life Sciences | SH30022 | |
| Dulbecco's Phophate Buffer Saline (PBS) solution | Hyclone, GE Healthcare life Sciences | SH30028 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone, GE Healthcare life Sciences | SH30088 | |
| Fine curved scissors stainless steel | FST | 14095-11 | |
| Fluoromount-G mounting media | Fisher scientific | 0100-01 | |
| Formalin solution, neutral buffered 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Isothesia Isoflurane | Henry Schein | NDC 11695-6776-2 | |
| Microcentrifuge tube 2ml | Denville Scientific | 1000945 | |
| Microtube 1.5ml | SARSTEDT | 72692005 | |
| Negative goat serum | Vector | S-1000 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 154022 | |
| Precision Glide needle 18G | BD | 305196 | |
| Razor blades steel back | Personna | 9412071 | |
| RNA lysis buffer (RLT) | Qiagen | 79216 | |
| Stainless Steel Beads, 5 mm | Qiagen | 69989 | |
| Superfrost/plus microscopic slides | Fisher scientific | 12-550-15 | |
| Tissue lyser LT | Qiagen | 69980 | |
| Tissue-Tek OCT | Sakura | 4583 | |
| 488 (goat anti-mouse) | Life Technologies | A11029 | 1/2000 dilution |
References
- Field, H. J., Hill, T. J. The pathogenesis of pseudorabies in mice following peripheral inoculation. Journal of General Virology. 23 (2), 145-157 (1974).
- Engel, J. P., Madigan, T. C., Peterson, G. M. The transneuronal spread phenotype of herpes simplex virus type 1 infection of the mouse hind footpad. Journal of Virology. 71 (3), 2425-2435 (1997).
- Guedon, J. M., et al. Neuronal changes induced by Varicella Zoster Virus in a rat model of postherpetic neuralgia. Virology. 482, 167-180 (2015).
- Pomeranz, L. E., Reynolds, A. E., Hengartner, C. J. Molecular biology of pseudorabies virus: impact on neurovirology and veterinary medicine. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 69 (3), 462-500 (2005).
- Wittmann, G., Rziha, H. J., Knipe, D. M., Howley, P. M. Aujeszky’s disease (pseudorabies) in pigs. Herpesvirus diseases of cattle, horses and pigs. 9, 230-325 (1989).
- Leman, A. D., Glock, R. D., Mengeling, W. L., Penny, R. H. C., Scholl, E., Straw, B. . Diseases of swine, 6th ed. , 209-223 (1986).
- Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia. BMC Research Notes. 9, 82 (2016).
- Sands, S. A., Leung-Toung, R., Wang, Y., Connelly, J., LeVine, S. M. Enhanced Histochemical Detection of Iron in Paraffin Sections of Mouse Central Nervous System Tissue: Application in the APP/PS1 Mouse Model of Alzheimer’s Disease. ASN Neuro. 8 (5), (2016).
- Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. Manual hematoxylin and eosin staining of mouse tissue sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (6), 655-658 (2014).
- Koyuncu, O. O., MacGibeny, M. A., Hogue, I. B., Enquist, L. W. Compartmented neuronal cultures reveal two distinct mechanisms for alpha herpesvirus escape from genome silencing. PLoS pathogens. 13 (10), 1006608 (2017).
- Laval, K., Vernejoul, J. B., Van Cleemput, J., Koyuncu, O. O., Enquist, L. W. Virulent Pseudorabies Virus Infection Induces a Specific and Lethal Systemic Inflammatory Response in Mice. Journal of Virology. 92 (24), 01614-01618 (2018).
- Laval, K., Van Cleemput, J., Vernejoul, J. B., Enquist, L. W. Alphaherpesvirus infection of mice primes PNS neurons to an inflammatory state regulated by TLR2 and type I IFN signaling. PLoS Pathogens. 15 (11), 1008087 (2019).
- Brittle, E. E., Reynolds, A. E., Enquist, L. W. Two modes of pseudorabies virus neuroinvasion and lethality in mice. Journal of Virology. 78 (23), 12951-12963 (2004).
- Mancini, M., Vidal, S. M. Insights into the pathogenesis of herpes simplex encephalitis from mouse models. Mammalian Genome: Official Journal of the International Mammalian Genome Society. 29 (7-8), 425-445 (2018).
- Kopp, S. J., et al. Infection of neurons and encephalitis after intracranial inoculation of herpes simplex virus requires the entry receptor nectin-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (42), 17916-17920 (2009).
- Wang, J. P., et al. Role of specific innate immune responses in herpes simplex virus infection of the central nervous system. Journal of Virology. 86 (4), 2273-2281 (2012).
- Haberthur, K., Messaoudi, I. Animal models of varicella zoster virus infection. Pathogens. 2 (2), 364-382 (2013).
- Sarova-Pinhas, I., Achiron, A., Gilad, R., Lampl, Y. Peripheral neuropathy in multiple sclerosis: a clinical and electrophysiologic study. Acta Neurologica Scandinavia. 91 (4), 234-238 (1995).
- MacGibeny, M. A., Koyuncu, O. O., Wirblich, C., Schnell, M. J., Enquist, L. W. Retrograde axonal transport of rabies virus is unaffected by interferon treatment but blocked by emetine locally in axons. PLoS Pathogens. 14 (7), 1007188 (2018).
- Hunsperger, E. A., Roehrig, J. T. Temporal analyses of the neuropathogenesis of a West Nile virus infection in mice. Journal of Neurovirology. 12 (2), 129-139 (2006).
- Swartwout, B. K., et al. Zika Virus Persistently and Productively Infects Primary Adult Sensory Neurons In Vitro. Pathogens. 6 (4), 49 (2017).
- Racaniello, V. R. One hundred years of poliovirus pathogenesis. Virology. 344 (1), 9-16 (2006).
