Tekrarla ilişkili olmayan ATG bağımlı çeviri ürünleri, tekrarlayan genişleme tabanlı hastalıkların patojenik özellikleridir. Açıklanan protokolün amacı, c. elegansmodel sisteminde davranışsal ve hücresel tahliller kullanarak bu peptidlerin neden olduğu toksisiteyi değerlendirmektir.
C. elegans yaygın olarak amiyotrofik Lateral Skleroz (ALS) ve Huntington hastalığı gibi tekrarlayan genişleme mutasyonlarının neden olduğu yaşa bağlı nörodejeneratif hastalıkların modelini yapmak için kullanılır. Son zamanlarda, tekrar genleşme içeren RNA’nın, tekrarla ilişkili olmayan AUG bağımlı (RAN) çevirisi olarak adlandırılan yeni bir protein çevirisi nin substratı olduğu gösterilmiştir. Kanonik çevirinin aksine, RAN çevirisi başlangıç kodonu gerektirmez ve yalnızca yinelemeler bir eşik uzunluğunu aştığında oluşur. Okuma çerçevesini belirlemek için başlangıç kodonu olmadığından, RAN çevirisi hem duyu hem de antisense RNA şablonlarından yineleme genişletme dizisi içeren tüm okuma karelerinde oluşur. Bu nedenle, RAN çeviri bir den altı olası hastalık ile ilişkili toksik peptidlerin sayısını genişletir. Şimdiye kadar, RAN çeviri sekiz farklı tekrar genişleme tabanlı nörodejeneratif ve nöromüsküler hastalıklarda belgelenmiştir. Her durumda, hangi RAN ürünlerinin toksik olduğu ve toksisite mekanizmalarının deşifre edilmesi, bu peptidlerin hastalık patofizyolojisine nasıl katkıda bulunduğukonusunda kritik bir adımdır. Bu yazıda, model sistemi C. elegansRAN peptidlerin toksisitesini ölçmek için stratejiler sayılmiyoruz. İlk olarak, gelişmekte olan C. elegansbüyüme ve hareketlilik RAN peptid toksisitesi ölçmek için prosedürleri açıklar. İkinci olarak, RAN peptidlerinin hareketlilik üzerindeki postgelişimsel, yaşa bağlı etkilerini ölçmek için bir tetkik ayrıntılı olarak açıklıyoruz. Son olarak, ran peptidlerin nöron morfolojisi üzerindeki etkilerini değerlendirmek için bir nörotoksisite tetkiktarif. Bu tahliller RAN peptid toksisitesi geniş bir değerlendirme sağlamak ve hastalık mekanizmaları veya tedavileri tanımlamak için büyük ölçekli genetik veya küçük molekül ekranları gerçekleştirmek için yararlı olabilir.
DNA tekrar dizilerinin uygunsuz genişlemesi amiyotrofik lateral skleroz (ALS), frontotemporal demans (FTD) ve Huntington hastalığı (HD)1gibi birçok nörodejeneratif hastalığın genetik temelini oluşturur. Bu hastalıklar için hücresel ve hayvansal modeller kurulmuş olmakla birlikte, bu koşulların altında yatan mekanizmalar iyi tanımlanmamıştır. Örneğin, HD Huntingtin protein Htt2için kodlama dizisinde bir CAG tekrar dizisinin genişlemeleri neden olur. CAG amino asit glutamin kodlar çünkü, CAG tekrar genişleme sonuçları bir polyGlutamin ekleme, veya polyQ, Htt içinde dizi genişletilmiş polyQ proteinleri form uzunluğu- ve toksisite ile ilişkili yaşa bağlı protein agregaları3,4. Şaşırtıcı bir şekilde, iki yeni çalışmalar poliQ dizisinin uzunluğu HD hastalığı başlangıçlı ana sürücü olmadığını düşündürmektedir, poliQ bağımsız faktörler de hastalığa katkıda bulunabilir düşündüren5,6.
Olası bir poliQ-bağımsız mekanizma protein çeviri repeat a Associated Non-AUG bağımlı (RAN) çeviri7olarak adlandırılan yeni keşfedilen türü içerir. Adından da anlaşılacağı gibi, RAN çevirisi yalnızca genişletilmiş bir yineleme sırası olduğunda oluşur ve kanonik bir başlangıç kodonu gerektirmez. Bu nedenle, RAN çevirisi üç farklı polipeptid üretmek için yinelemenin üç okuma karesinde de gerçekleşir. Buna ek olarak, birçok gen de genişletilmiş tekrar dizisinin ters tamamlayıcı içeren bir antisense transkript üretmek çünkü, RAN çeviri de antisense transkript her üç okuma kareoluşur. Birlikte, RAN çevirisi genişletilmiş tekrar içeren DNA dizisinden üretilen protein sayısını bir peptitten altı peptide genişletir. Bugüne kadar, RAN çeviri en az sekiz farklı tekrar genişleme bozukluklarıgözlenmiştir 8. RAN peptidler postmortem hasta örneklerinde gözlenir ve sadece hastanın genişletilmiş tekrar ı taşıdığı durumlarda9,10. Bu peptidler hasta hücrelerinde açıkça mevcut olmakla birlikte, hastalık patofizyolojisine katkıları belirsizdir.
Daha iyi RAN peptidler ile ilişkili potansiyel toksisite tanımlamak için, çeşitli gruplar maya, sinek, fare ve doku kültürü hücreleri11,12,,13,14,15,16gibi çeşitli model sistemlerinde her peptid ifade var. Bu modeller, ifade için yineleme dizisini kullanmak yerine, yineleme sırasının ortadan kaldırıldığı ancak amino asit dizisinin korunduğu bir kodon varyasyonu yaklaşımı kullanır. Çeviri başlatma bir kanonik ATG yoluyla oluşur ve peptit genellikle n floresan protein erimiş- veya C-terminus, her ikisi de RAN peptid toksisitesi ile müdahale gibi görünüyor. Bu nedenle, her yapı tek bir RAN peptid aşırı ifade eder. RAN peptid toksisitesini ölçmek için basit tahliller ile çok hücreli bir organizmada farklı RAN ürünleri modelleme her hastalık neden tekrar genişleme farklı RAN ürünleri hücresel disfonksiyon ve nörodejenerasyon katkıda nasıl anlamak için hayati önem taşımaktadır.
Diğer model sistemleri gibi, C. elegans ran peptid toksisitesi gibi yeni hastalık mekanizmaları, çalışmalar sağlayan esnek ve verimli bir deneysel platform sağlar. Solucanlar şu anda RAN peptid toksisitesi diğer modellerde mevcut olmayan birkaç benzersiz deneysel özellikleri sunuyoruz. Birincisi, C. elegans doğuştan ölüme optik saydamdır. Bu RAN peptid ekspresyonu ve lokalizasyonu basit görselleştirme sağlar, hem de canlı hayvanlarda nörodejenerasyon in vivo analizi. İkinci olarak, RAN peptit ekspresyonu modelleri oluşturmak için transgenik yöntemler ucuz ve hızlıdır. C. eleganskısa üç günlük yaşam döngüsü göz önüne alındığında, bir hücre tipi özel bir şekilde herhangi bir RAN peptid ifade kararlı transgenik çizgiler bir hafta altında üretilebilir. Üçüncü olarak, basit henotipik çıkışlar, RAN peptid toksisitesi için gerekli genleri hızla tanımlamak için kimyasal mutagenez veya RNAi taraması gibi genetik tarama yöntemleri ile kombine edilebilir. Son olarak, C. elegans kısa ömrü (~ 20 gün) araştırmacılar nasıl yaşlanma belirlemek için izin verir, en tekrar genişleme hastalıkları için en büyük risk faktörü olan, RAN peptid toksisitesi etkiler. Birlikte, deneysel özellikleri bu kombinasyonu başka bir model sisteminde eşsiz ve RAN peptid toksisitesi çalışması için güçlü bir platform sunuyor.
Burada, RAN peptidlerinin toksisitesini ölçmek ve bu toksisitenin genetik değiştiricilerini belirlemek için C. elegans’ın deneysel avantajlarından yararlanan birkaç tahlilleri tanımlıyoruz. Kodon çeşitli ATG-başlatılan RAN peptidler GFP ile etiketlenir ve unc-47 organizatörü altında myo-3 organizatörü altında kas hücrelerinde ya da GABAerjik motor nöronlarda bireysel olarak ifade edilir. Kas hücrelerinde ifade için, toksik RAN peptidler yeşil floresan protein ile etiketlenir önemlidir (GFP), veya diğer floresan protein (FP) etiketi bir RNAi besleme vektörü ile hedeflenebilir. Toksik RAN peptid ekspresyonu genellikle büyüme engeller, bu tür suşları cansız hale olmasıdır. Gfp(RNAi) kullanımı koşullu OLARAK RAN peptid ekspresyonunu inaktive eder ve gerinim bakımı, genetik haçlar, vb. sağlar. Tahliller için, bu hayvanlar gfp kaldırılır (RNAi), RAN peptid ve ortaya çıkan fenotiplerin ifade sağlar. Kodon çeşitli RAN peptid ekspresyonu yapıları tasarlamak için moleküler stratejiye ek olarak, gelişimsel toksisite (larva hareketliliği ve büyüme tahlilleri), gelişim sonrası yaşla ilişkili toksisite (paralizi tahlil) ve nöron morfolojik defektleri (komissitöz tahlil) ölçmek için tahliller tanımlarız.
Burada kas veya C. elegansnöronlarda modellenmiş RAN peptid toksisitesi titretini saymak için kullanılabilecek yöntemleri rapor ediyoruz. Nörodejeneratif proteinler insan hastalarında bir yaş başlangıçlı fenotip olsa da, onlar da model sistemlerinde aşırı ifade zaman gelişimsel toksisite sergileyebilir. Aşırı ifadenin önemli yorumlayıcı sınırlamaları vardır, ancak aynı zamanda toksik fenotipleri tersine çevirebilen genleri veya ilaçları tanımlamayı amaçlayan genetik veya farmakol…
The authors have nothing to disclose.
NIH R21NS107797
35mm x 10mm Petri Dish, Sterile | CELLTREAT Scientific Products | 50-202-036 | Nematode growth plates and RNAi |
AGAR GRANULATED 2KILOGRAM | BD DIAGNOSTIC SYSTEMS | DF0145070 | Nematode growth plates and RNAi |
AGAROSE ULTRAPURE | LIFE TECHNOLOGIES | 16500500 | Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains |
CARBENICILLIN 5G | THERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALS | BP26485 | Nematode growth plates and RNAi |
COVER GLASSES NO 1 22MM 1OZ/PK | THERMO SCI ERIE | 12542B | Imaging for commissure assay |
FEMOTIPS DISPSBL MICROINJ 20CS | EPPENDORF NORTH AMERICA BIOTOOLS | E5242952008 | Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains |
FF COV GLASS NO1 40X22MM 1OZPK | THERMO SCI ERIE | 125485C | Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains |
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | THERMO SCI ERIE | 12-550-15 | Imaging for commissure assay |
Gibco Bacto Peptone | Gibco | DF0118-17-0 | Nematode growth plates and RNAi |
HALOCARBON OIL 700 | SIGMA-ALDRICH INC | H8898-50ML | Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains |
IPTG BIOTECH 10G | THERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALS | BP162010 | Nematode growth plates and RNAi |
Leica Advanced Fluorescence imaging software | Leica Microsystems | LAS-AF | Image acquisition software for video speed analysis and commissure assay |
Leica Immersion type N (Oil) | W NUHSBAUM INC | NC9547002 | Imaging for commissure assay |
LEVAMISOLE HYDROCHLORIDE 10GR | THERMO SCI ACROS ORGANICS | AC187870100 | Imaging for commissure assay |
MICROLOADER TIPS 2 X 96 PCS | EPPENDORF NORTH AMERICA BIOTOOLS | E5242956003 | Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains |
PETRI DISH, 60X15MM,500/CS |
CORNING LIFE SCIENCES PLASTIC | FB0875713A | Nematode growth plates and RNAi |
TISSUE CULT PLATE 24WEL 50/CS | CORNING LIFE SCIENCES DL | 87721 | Nematode growth plates and RNAi |