מוצרי העברה שאינם תלויי ATG הקשורים לחזרה מתגלים כתכונות פתוגניים של מחלות מבוססות הרחבה חוזרות. מטרת הפרוטוקול המתואר היא להעריך רעילות הנגרמת על ידי פפטידים אלה באמצעות בחני התנהגות הסלולר מערכת המודל C. אלגיה.
ג. אלגיה משמש בדרך כלל למודל מחלות ניווניות הקשורות לגיל הנגרמת על ידי מוטציות התרחבות חוזרות, כגון טרשת Amyotrophic לרוחב (ALS) ומחלת הנטינגטון. לאחרונה, חזרה על הרחבה המכילה RNA הוכח להיות מצע עבור סוג הרומן של תרגום חלבון שנקרא לחזור על-ידי הקשורים לא אוגוסט תלוי (רן) תרגום. בשונה מתרגום קאנוני, תרגום רן אינו דורש התחלה של מפעיל ומתרחש רק כאשר החזרה עולה על אורך הסף. מכיוון שאין להתחיל קודון לקבוע את מסגרת הקריאה, תרגום RAN מתרחשת בכל מסגרות הקריאה מתוך הגיון ואנטי היגיון תבניות RNA המכילות רצף הרחבה חוזרת. לכן, תרגום הראן מרחיב את מספר הפפטידים האפשריים הקשורים למחלות רעילות מאחד לשש. עד כה, התרגום של רן תועד בשמונה שונות של התרחבות ומחלות נוירוניווניות המבוססות על הרחבה. בכל מקרה, פענוח אשר מוצרי ראן רעילים, כמו גם מנגנוני רעילות שלהם, הוא צעד קריטי לקראת הבנה כיצד אלה פפטידים לתרום פתופסיולוגיה המחלה. במאמר זה, אנו מציגים אסטרטגיות כדי למדוד את רעילות של פפטידים RAN במערכת דגם C. אלגיה. ראשית, אנו מתארים הליכים למדידת רעילות של מבני רן על הצמיחה והתנועתיות של התפתחות C. אלגיה. שנית, אנו מפרטים את התשובה למדידת ההשפעות ההתפתחותיות, התלויות בגיל של פפטידים של RAN בתנועתיות. לבסוף, אנו מתארים שיטת רעילות עצבית להערכת ההשפעות של פפטידים בראן על מורפולוגיה של תא העצב. מספר זה מספק הערכה רחבה של רעילות בתלת-המידה של פפטיד, ועשוי להועיל לביצוע מסכי מולקולות גנטיות או קטנות כדי לזהות מנגנוני מחלות או תרפיות.
ההתרחבות הבלתי הולמת של רצפים חוזרים DNA הוא הבסיס הגנטי עבור מחלות ניווניות מספר כגון טרשת amyotrophic לרוחב (ALS), דמנציה הפרופנטיסטית (FTD), ו מחלת הנטינגטון (HD)1. בעוד יש מבוססים מודלים סלולריים ובעלי חיים עבור מחלות אלה, מנגנונים המשמשים את התנאים הללו אינם מוגדרים היטב. לדוגמה, HD נגרמת על ידי הרחבות של רצף החזרה של הקאג ברצף הקידוד של החלבון Htt2. כי הקאג מקודד את החומצה האמינית גלוטמין, התרחבות חזרה הקאג התוצאות בהוספה של polyglutamine, או polyglutamine, רצף בתוך htt. מורחבת חלבונים polyglutamine הטופס באורך והגיל מצרפים מזיבי החלבון המשויכים רעילות3,4. למרבה ההפתעה, שני מחקרים שנעשו לאחרונה מראים כי אורכו של רצף polyq הוא לא הנהג העיקרי של התפתחות HD מחלה, מציע כי גורמים בלתי תלויים polyq עשוי גם לתרום למחלה5,6.
אחד אפשרי polyQ המנגנון העצמאי כולל סוג חדש של תרגום חלבון כינה REpeat aSSOCIATED NON-אוג-תלוי (רן) תרגום7. כפי ששמה מרמז, תרגום רן מתרחש רק כאשר קיים רצף חוזר מורחב ואינו דורש התחלה קאנונית. לכן, תרגום רן מתרחש בכל שלושת מסגרות הקריאה של החזרה כדי לייצר שלושה פוליפפטידים ברורים. בנוסף, מכיוון שגנים רבים מייצרים גם תעתיק אנטי-חוש המכיל את ההשלמה ההפוכה של רצף החזרה המורחב, תרגום הראן מתרחש גם בכל שלושת מסגרות הקריאה של התעתיק האנטי-הגיוני. יחד, תרגום רן מרחיב את מספר החלבונים המיוצרים מתוך רצף מורחב חוזר המכיל DNA מ פפטיד אחד עד שישה פפטידים. עד כה, תרגום רן נצפה בלפחות שמונה הפרעות חוזרות שונות של התרחבות8. פפטידים הרצתי נצפו בדגימות המטופל שלאחר המוות ורק במקרים שבהם המטופל נושא חזרה מורחבת9,10. בעוד פפטידים אלה נמצאים בבירור בתאי החולה, תרומתם למחלות פתופסיולוגיה אינה ברורה.
כדי להגדיר טוב יותר את הרעילות הפוטנציאל הקשורים עם הפפטידים RAN, מספר קבוצות הביעו כל פפטיד במערכות מודל שונות, כגון שמרים, זבובים, עכברים, והתרבות רקמות תאים11,12,13,14,15,16. במקום להשתמש ברצף החזרה של הביטוי, מודלים אלה מעסיקים גישה מקודון וריאציה שבה רצף החזרה מסולק, אך רצף חומצת האמינו נשמר. החניכה בתרגום מתרחשת באמצעות ATG קאנונית והפפטיד בדרך כלל מותכות לחלבון פלורסנט ב-N-או C-טרמינוס, שאף אחד מהם אינו מפריע לרעילות ה-RAN. לכן כל אחד מהמבנה מבטא פפטיד בודד. מידול מוצרים שונים של RAN באורגניזם משני עם בחני פשוטה למדוד רעילות הפפטיד של הראן הוא החשוב ביותר כדי להבין כיצד מוצרי RAN שונים של כל מחלה-גרימת התרחבות חוזרת לתרום לתפקוד התאי וניוון המוח.
כמו מערכות מודל אחרות, C. אלגיה מספקת פלטפורמה ניסיונית גמישה ויעילה המאפשרת מחקרים של מנגנוני מחלה חדשים, כגון רעילות של מחלות מסוג RAN. תולעים מציעות מספר תכונות נסיוניות ייחודיות שאינן זמינות כרגע במודלים אחרים של הרעלת פפטיד בראן. ראשית, הג הם שקופים מהלידה עד המוות. זה מאפשר הדמיה פשוטה של ביטוי פפטיד ולוקליזציה של הראן, כמו גם בניתוח vivo של ניוון מוחי בבעלי חיים חיים. שיטות שניות ליצירת מודלים של ביטוי פפטיד בשיטת RAN הם זולים ומהירים. בהינתן מחזור החיים הקצר של שלושה ימים של C. אלגיה, קווים טרנסגניים יציבים המבטא כל פפטיד RAN נתון בצורה מסוימת של סוג תא ניתן לייצר בתוך פחות משבוע. שלישית, פלטי פנוטים פשוטים יכולים להיות משולבים עם שיטות סינון גנטי, כגון מוטזיס כימי או הקרנת RNAi, כדי לזהות במהירות גנים חיוניים של הרעלת פפטיד בראן. לבסוף, תוחלת החיים הקצרה של הג (~ 20 יום) מאפשרת לחוקרים לקבוע את מידת ההזדקנות, שהיא גורם הסיכון הגדול ביותר למחלות התרחבות חוזרות ומחלות, השפעות רעילות מהפפטיד. יחד, שילוב זה של מאפיינים ניסיוניים הוא ללא תחרות בכל מערכת מודל אחרת והוא מציע פלטפורמה רבת עוצמה לחקר רעילות פפטיד בראן.
כאן אנו מתארים מספר שאומר כי למנף את היתרונות הניסיוניים של C. אלגיה כדי למדוד את הרעילות של פפטידים בראן ולזהות מכפילי גנטי של רעילות זו. Codon-מגוון מגוונת ATG-פפטידים רץ מתויגים עם GFP והביע בנפרד בתאי שריר תחת מקדם myo-3 או בנוירונים מוטוריים GABAergic תחת unc-47 יזם. לביטוי בתאי שריר, חשוב כי הפפטידים רץ רעילים מתויגים עם חלבון פלורסנט ירוק (GFP), או חלבון פלורסנט אחרים (FP) תג כי ניתן לפלח עם וקטור האכלה RNAi. הסיבה לכך היא ביטוי ביטויים רעילים מסוג RAN בדרך כלל חוסם את הצמיחה, עיבוד זנים כאלה ללא קיימא. השימוש gfp (RNAi) מותנית בביטוי פפטיד ביטוי מאפשר מאמץ, צלבים גנטיים, וכו ‘. עבור assays בעלי חיים אלה יוסרו gfp (RNAi), אשר מאפשר ביטוי של הפפטיד RAN ואת הפנוטיפים כתוצאה מכך. בנוסף לאסטרטגיה המולקולרית לעיצוב מבני ביטוי מגוונים בעלי מגוון של מבנים, אנו מתארים את הנושא למדידת רעילות התפתחותית (הזחל ושיטת הצמיחה), הרעילות לאחר גיל התפתחותי (שיטת שיתוק), ומומים מורפולוגיים (מזנון בטוח).
כאן אנו מדווחים על שיטות שניתן להשתמש בהן כדי לעצב את הרעילות של פפטיד המודל בשריר או בנוירונים של ג. אלגיה. בעוד חלבונים נוירוניווניות יש הופעת גיל פנוטיפ בחולים אנושיים, הם יכולים גם להפגין רעילות מנטלית כאשר מתבטאת במערכות מודל. ביטוי יתר יש מגבלות הפרשנות משמעותי, אבל זה גם מספק נק…
The authors have nothing to disclose.
NIH R21NS107797
35mm x 10mm Petri Dish, Sterile | CELLTREAT Scientific Products | 50-202-036 | Nematode growth plates and RNAi |
AGAR GRANULATED 2KILOGRAM | BD DIAGNOSTIC SYSTEMS | DF0145070 | Nematode growth plates and RNAi |
AGAROSE ULTRAPURE | LIFE TECHNOLOGIES | 16500500 | Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains |
CARBENICILLIN 5G | THERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALS | BP26485 | Nematode growth plates and RNAi |
COVER GLASSES NO 1 22MM 1OZ/PK | THERMO SCI ERIE | 12542B | Imaging for commissure assay |
FEMOTIPS DISPSBL MICROINJ 20CS | EPPENDORF NORTH AMERICA BIOTOOLS | E5242952008 | Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains |
FF COV GLASS NO1 40X22MM 1OZPK | THERMO SCI ERIE | 125485C | Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains |
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | THERMO SCI ERIE | 12-550-15 | Imaging for commissure assay |
Gibco Bacto Peptone | Gibco | DF0118-17-0 | Nematode growth plates and RNAi |
HALOCARBON OIL 700 | SIGMA-ALDRICH INC | H8898-50ML | Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains |
IPTG BIOTECH 10G | THERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALS | BP162010 | Nematode growth plates and RNAi |
Leica Advanced Fluorescence imaging software | Leica Microsystems | LAS-AF | Image acquisition software for video speed analysis and commissure assay |
Leica Immersion type N (Oil) | W NUHSBAUM INC | NC9547002 | Imaging for commissure assay |
LEVAMISOLE HYDROCHLORIDE 10GR | THERMO SCI ACROS ORGANICS | AC187870100 | Imaging for commissure assay |
MICROLOADER TIPS 2 X 96 PCS | EPPENDORF NORTH AMERICA BIOTOOLS | E5242956003 | Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains |
PETRI DISH, 60X15MM,500/CS |
CORNING LIFE SCIENCES PLASTIC | FB0875713A | Nematode growth plates and RNAi |
TISSUE CULT PLATE 24WEL 50/CS | CORNING LIFE SCIENCES DL | 87721 | Nematode growth plates and RNAi |