المنتجات المترجمة غير المعتمدة على ATG المتكررة هي ميزات مسببة للأمراض الناشئة للعديد من الأمراض المتكررة القائمة على التوسع. الهدف من البروتوكول الموصوف هو تقييم السمية الناجمة عن هذه الببتيدات باستخدام المقالات السلوكية والخلوية في النظام النموذجي C. elegans.
C. elegans يستخدم عادة لنموذج الأمراض العصبية المرتبطة بالعمر الناجمة عن الطفرات التوسع ية المتكررة, مثل التصلب الجانبي الضموري (ALS) ومرض هنتنغتون. في الآونة الأخيرة ، تبين أن تكرار التوسع الذي يحتوي على الحمض النووي الريبي هو الركيزة لنوع جديد من ترجمة البروتين يسمى تكرار المرتبطة AUG تعتمد (RAN) الترجمة. على عكس الترجمة الكنسية، لا تتطلب ترجمة RAN بدء codon ويحدث فقط عندما يتجاوز التكرار طول عتبة. نظرًا لعدم وجود codon بدء لتحديد إطار القراءة ، تحدث ترجمة RAN في جميع إطارات القراءة من كل من قوالب الحمض النووي الريبي المنطقية وantisense التي تحتوي على تسلسل توسيع متكرر. لذلك ، توسع ترجمة RAN عدد الببتيدات السامة المحتملة المرتبطة بالأمراض من واحد إلى ستة. حتى الآن، تم توثيق ترجمة RAN في ثمانية مختلفة تكرار التوسع القائم على الأمراض العصبية والعصبية العضلية. في كل حالة ، فك رموز المنتجات التي RAN سامة ، فضلا عن آليات ها من السمية ، هو خطوة حاسمة نحو فهم كيفية هذه الببتيدات تسهم في علم الفيزيولوجيا المرض. في هذه الورقة، ونحن نقدم استراتيجيات لقياس سمية الببتيدات RAN في النظام النموذجي C. elegans. أولا، نحن نصف إجراءات لقياس سمية الببتيد RAN على نمو وحركية تطوير C. elegans. ثانياً، نحن نفصّل فحصاً لقياس الآثار المعتمدة على العمر بعد النمو من الببتيدات RAN على الحركة. وأخيرا، نحن نصف السمية العصبية المقاهل لتقييم آثار الببتيدات RAN على مورفولوجيا الخلايا العصبية. توفر هذه المقالات تقييمًا واسعًا لسمية الببتيد RAN وقد تكون مفيدة في إجراء شاشات جزيئات وراثية أو صغيرة واسعة النطاق لتحديد آليات المرض أو العلاجات.
التوسع غير المناسب لتسلسل تكرار الحمض النووي هو الأساس الوراثي للعديد من الأمراض العصبية مثل التصلب الجانبي الضموري (ALS) ، والخرف الجبهي الصدغي (FTD) ، ومرض هنتنغتون (HD)1. وفي حين أن هناك نماذج خلوية والحيوانات راسخة لهذه الأمراض، فإن الآليات التي تقوم عليها هذه الظروف ليست محددة بشكل جيد. على سبيل المثال، يحدث HD بسبب التوسعات في تسلسل تكرار CAG في تسلسل الترميز لبروتين هنتنغتين Htt2. لأن CAG ترميز الجلوتامين الأحماض الأمينية، والنتائج توسيع CAG تكرار في إدراج polyGlutamine، أو polyQ، تسلسل داخل Htt. البروتينات متعددة الجوانب الموسعة تشكل مجاميع البروتين تعتمد على الطول والعمر التي ترتبط مع سمية3،,4. ومن المدهش أن دراستين حديثتين تشيران إلى أن طول تسلسل البولي كيو ليس المحرك الرئيسي لظهور مرض HD ، مما يشير إلى أن العوامل المستقلة عن تعدد الحلقات قد تساهم أيضًا في المرض5،6.
تتضمن إحدى الآليات المستقلة الممكنة متعددة الحلقات نوعًا مكتشفًا حديثًا من ترجمة البروتين يسمى Repeat Associated Non-AUG-AUG-on-AUG-on-AUG-on-AUG-on-AUG-on-AUG-on-AUG-on-AUG-on-AUG-on.R- الترجمة7. كما يوحي اسمها، تحدث ترجمة RAN فقط عندما يكون تسلسل تكرار الموسعة موجودة ولا تتطلب codon بدء الكنسي. لذلك ، تحدث ترجمة RAN في جميع إطارات القراءة الثلاثة للتكرار لإنتاج ثلاثة polypeptides متميزة. بالإضافة إلى ذلك ، لأن العديد من الجينات تنتج أيضًا نسخة مضادة للمعنى تحتوي على تكملة عكسية لتسلسل التكرار الموسع ، تحدث ترجمة RAN أيضًا في جميع إطارات القراءة الثلاثة لنسخة antisense. معا، RAN الترجمة يوسع عدد البروتينات المنتجة من تسلسل الحمض النووي الموسعة التي تحتوي على تكرار من ببتيد واحد إلى ستة ببتيدات. حتى الآن، وقد لوحظ ترجمة RAN في ما لا يقل عن ثمانية اضطرابات مختلفة التوسع تكرار8. ويلاحظ الببتيدات RAN في عينات المريض بعد الوفاة وفقط في الحالات التي يحمل فيها المريض تكرار الموسعة9,10. في حين أن هذه الببتيدات موجودة بوضوح في خلايا المريض ، فإن مساهمتها في الفيزيولوجيا المرضية غير واضحة.
لتحديد أفضل سمية المحتملة المرتبطة الببتيدات RAN، وقد أعربت عدة مجموعات كل الببتيد في أنظمة نموذج مختلف، مثل الخميرة والذباب والفئران، وخلايا زراعة الأنسجة11،12،13،14،15،16. بدلا من استخدام تكرار تسلسل للتعبير، وتستخدم هذه النماذج نهج codon الاختلاف الذي يتم القضاء على تسلسل تكرار ولكن يتم الحفاظ على تسلسل الأحماض الأمينية. بدء الترجمة يحدث من خلال ATG الكنسي وعادة ما تنصهر الببتيد إلى بروتين الفلورسنت في إما N- أو C-terminus، لا يبدو أن أي منهما يتداخل مع سمية الببتيد RAN. لذلك ، كل بناء يبالغ في التعبير عن ببتيد RAN واحد. نمذجة منتجات RAN المختلفة في كائن متعدد الخلايا مع المقاييس البسيطة لقياس سمية الببتيد RAN أمر بالغ الأهمية لفهم كيف تساهم منتجات RAN المختلفة من كل توسع متكرر يسبب المرض في الخلل الوظيفي الخلوي وتوليد الأعصاب.
مثل الأنظمة النموذجية الأخرى، يوفر C. elegans منصة تجريبية مرنة وفعالة تمكن من إجراء دراسات لآليات المرض الجديدة، مثل سمية الببتيد RAN. الديدان تقدم العديد من السمات التجريبية الفريدة التي لا تتوفر حاليا في نماذج أخرى من سمية الببتيد RAN. أولاً، C. elegans شفافة بصرياً منذ الولادة حتى الموت. وهذا يسمح للتصور بسيطة من التعبير الببتيد RAN والتعريب، وكذلك في تحليل الحي من التنكس العصبي في الحيوانات الحية. ثانيا، الأساليب المعدلة وراثيا لتوليد نماذج التعبير الببتيد RAN غير مكلفة وسريعة. ونظرا لدورة حياة قصيرة لمدة ثلاثة أيام من C. elegans,خطوط المعدلة وراثيا مستقرة تعبر عن أي ببتيد ران معين بطريقة محددة من نوع الخلية يمكن إنتاجها في أقل من أسبوع. ثالثاً، يمكن الجمع بين النواتج البسيطة الفينوتيبية مع طرق الفحص الجيني، مثل الطفرات الكيميائية أو فحص الحمض النووي الريبي، لتحديد الجينات الضرورية بسرعة لسمية الببتيد RAN. وأخيرا، فإن عمر قصيرة من C. elegans (~ 20 يوما) يسمح للمحققين لتحديد كيفية الشيخوخة، والتي هي أكبر عامل خطر لمعظم أمراض التوسع المتكررة، ويؤثر على سمية الببتيد RAN. معا، هذا المزيج من الصفات التجريبية لا مثيل لها في أي نظام نموذج آخر، ويقدم منصة قوية لدراسة سمية الببتيد RAN.
هنا نصف العديد من المقالات التي تستفيد من المزايا التجريبية لC. elegans لقياس سمية الببتيدات RAN وتحديد المعدلات الوراثية لهذه السمية. يتم وضع علامة على الببتيدات RAN التي بدأتها ATG codon المتنوعة مع GFP ويتم التعبير عنها بشكل فردي في أي من خلايا العضلات تحت مروج myo-3 أو في الخلايا العصبية الحركية GABAergic تحت مروج UNC-47. للتعبير في خلايا العضلات، من المهم أن يتم وضع علامات على الببتيدات RAN السامة مع البروتين الفلوري الأخضر (GFP)، أو غيرها من البروتين الفلوري (FP) العلامة التي يمكن استهدافها مع ناقل تغذية RNAi. وذلك لأن التعبير الببتيد RAN السامة عادة ما يمنع النمو، مما يجعل مثل هذه السلالات غير قابلة للحياة. استخدام gfp (RNAi) يعطل بشكل مشروط التعبير الببتيد RAN ويسمح صيانة سلالة، والصلبان الوراثية، الخ. للمقالات ، تتم إزالة هذه الحيوانات من gfp (RNAi)، مما يسمح بالتعبير عن الببتيد RAN والأنماط الظاهرية الناتجة. بالإضافة إلى الاستراتيجية الجزيئية لتصميم الببتيد المتنوعة codon بنيات التعبير، ونحن وصف المقالات لقياس سمية النمو (حركية اليرقات والقدرة على النمو)، والسمية المرتبطة بالعمر بعد النمو (قياس الشلل)، والعيوب المورفولوجية العصبية (فحص commissure).
هنا نبلغ عن الطرق التي يمكن استخدامها لاساي RAN الببتيد سمية على غرار في العضلات أو في الخلايا العصبية من C. elegans. في حين أن البروتينات العصبية التنكسية لها نمط ظاهري في بداية العمر في المرضى البشريين ، فإنها يمكن أن تظهر أيضًا سمية تنموية عندما يتم التعبير عنها بشكل مفرط في الأنظمة النم?…
The authors have nothing to disclose.
المعاهد القومية للصحة R21NS107797
35mm x 10mm Petri Dish, Sterile | CELLTREAT Scientific Products | 50-202-036 | Nematode growth plates and RNAi |
AGAR GRANULATED 2KILOGRAM | BD DIAGNOSTIC SYSTEMS | DF0145070 | Nematode growth plates and RNAi |
AGAROSE ULTRAPURE | LIFE TECHNOLOGIES | 16500500 | Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains |
CARBENICILLIN 5G | THERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALS | BP26485 | Nematode growth plates and RNAi |
COVER GLASSES NO 1 22MM 1OZ/PK | THERMO SCI ERIE | 12542B | Imaging for commissure assay |
FEMOTIPS DISPSBL MICROINJ 20CS | EPPENDORF NORTH AMERICA BIOTOOLS | E5242952008 | Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains |
FF COV GLASS NO1 40X22MM 1OZPK | THERMO SCI ERIE | 125485C | Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains |
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | THERMO SCI ERIE | 12-550-15 | Imaging for commissure assay |
Gibco Bacto Peptone | Gibco | DF0118-17-0 | Nematode growth plates and RNAi |
HALOCARBON OIL 700 | SIGMA-ALDRICH INC | H8898-50ML | Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains |
IPTG BIOTECH 10G | THERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALS | BP162010 | Nematode growth plates and RNAi |
Leica Advanced Fluorescence imaging software | Leica Microsystems | LAS-AF | Image acquisition software for video speed analysis and commissure assay |
Leica Immersion type N (Oil) | W NUHSBAUM INC | NC9547002 | Imaging for commissure assay |
LEVAMISOLE HYDROCHLORIDE 10GR | THERMO SCI ACROS ORGANICS | AC187870100 | Imaging for commissure assay |
MICROLOADER TIPS 2 X 96 PCS | EPPENDORF NORTH AMERICA BIOTOOLS | E5242956003 | Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains |
PETRI DISH, 60X15MM,500/CS |
CORNING LIFE SCIENCES PLASTIC | FB0875713A | Nematode growth plates and RNAi |
TISSUE CULT PLATE 24WEL 50/CS | CORNING LIFE SCIENCES DL | 87721 | Nematode growth plates and RNAi |