Повторные не-ATG-зависимые трансляционные продукты являются патогенными особенностями нескольких повторных заболеваний, основанных на расширении. Цель описанного протокола заключается в оценке токсичности, вызванной этими пептидами с помощью поведенческих и клеточных анализов в модельной системе C. elegans.
C. elegans обычно используется для моделирования возрастных нейродегенеративных заболеваний, вызванных повторными мутациями расширения, такими как амиотрофический боковой склероз (ALS) и болезнь Гентингтона. Недавно было показано, что повторное расширение, содержащее РНК, является субстратом для нового типа белкового перевода, называемого повторным независимым (РАН). В отличие от канонического перевода, перевод РАН не требует начала кодона и происходит только тогда, когда повторы превышают пороговую длину. Поскольку нет стартового кодона для определения кадра чтения, перевод RAN происходит во всех кадрах чтения как из смысла, так и из шаблонов РНК- антисмыслов, которые содержат последовательность повторения расширения. Таким образом, перевод РАН увеличивает количество возможных связанных с болезнью токсичных пептидов с одного до шести. До сих пор перевод РАН был задокументирован в восьми различных нейродегенеративных и нервно-мышечных заболеваниях, основанных на повторном расширении. В каждом случае расшифровка продуктов РАН, которые являются токсичными, а также их механизмы токсичности, является важным шагом на пути к пониманию того, как эти пептиды способствуют патологиологии болезни. В этой работе мы представляем стратегии для измерения токсичности пептидов RAN в модельной системе C. elegans. Во-первых, мы описываем процедуры измерения токсичности пептида РАН на рост и подвижность развивающихся C. elegans. Во-вторых, мы подробно ассси для измерения постразвития, возрастно-зависимых эффектов пептидов РАН на подвижность. Наконец, мы описываем нейротоксичность асссы для оценки влияния пептидов РАН на морфологию нейронов. Эти анализы обеспечивают широкую оценку токсичности пептида RAN и могут быть полезны для выполнения крупномасштабных генетических или малых молекул экранов для выявления механизмов заболевания или терапии.
Неуместное расширение последовательностей повторения ДНК является генетической основой для нескольких нейродегенеративных заболеваний, таких как боковой амиотрофический склероз (ALS), фронтотемпоральная деменция (FTD) и болезнь Гентингтона (HD)1. Хотя существуют клеточные и животные модели для этих заболеваний, механизмы, лежащие в основе этих условий, не четко определены. Например, HD вызвано расширением последовательности повтора CAG в последовательности кодирования для белка Хантингтин Htt2. Потому что CAG кодирует аминокислоты глутамин, CAG повторить расширение приводит к вставке полиглютамина, или поли, последовательность в Htt. Расширенный поли” белки образуют длину и возраст-зависимых белковых агрегатов, которые связаны с токсичностью3,4. Удивительно, но два последних исследования показывают, что длина последовательности поли” не является основным фактором начала заболевания БГ, предполагая, что поли- независимые факторы могут также способствовать болезни5,6.
Один из возможных поли- независимый механизм включает в себя недавно обнаруженный тип белка перевод называется Repeat Associated Nна-AUG-зависимых (RAN) перевод7. Как следует из названия, перевод РАН происходит только тогда, когда присутствует расширенная повторная последовательность и не требует канонического старта кодона. Таким образом, перевод РАН происходит во всех трех кадрах чтения повтора для получения трех различных полипептидов. Кроме того, поскольку многие гены также производят антисмысловую транскрипт, содержащую обратный дополнение расширенной последовательности повтора, перевод RAN также происходит во всех трех кадрах чтения антисмыслового транскрипта. В совокупности перевод РАН расширяет количество белков, вырабатываемых из расширенной повторяющихся последовательностей ДНК, от одного пептида до шести пептидов. На сегодняшний день перевод РАН наблюдается по крайней мере в восьми различных нарушениях повторного расширения8. Пептиды РАН наблюдаются в посмертных образцах пациентов и только в тех случаях, когда пациент несет расширенное повтор9,,10. Хотя эти пептиды явно присутствуют в клетках пациента, их вклад в патофизиологию болезни неясен.
Чтобы лучше определить потенциальную токсичность, связанную с пептидами RAN, несколько групп выразили каждый пептид в различных модельных системах, таких как дрожжи, мухи, мыши и клетки культуры тканей11,,12,,13,,1515,16., Вместо того, чтобы использовать повторную последовательность для выражения, эти модели используют подход кодон-вариации, в котором повторяющаяся последовательность устраняется, но аминокислотная последовательность сохраняется. Инициация перевода происходит через канонический АТГ и пептид, как правило, сливается с флуоресцентным белком либо n- или C-терминус, ни один из которых, как представляется, вмешиваться в RAN пептид токсичности. Поэтому каждая конструкция переэкспрессирует один пептид РАН. Моделирование различных продуктов РАН в многоклеточном организме с простыми анализами для измерения токсичности пептида РАН жизненно важно понять, как различные продукты РАН от каждого вызывающего заболевание повторного расширения способствуют клеточной дисфункции и нейродегенерации.
Как и другие модельные системы, C. elegans обеспечивает гибкую и эффективную экспериментальную платформу, которая позволяет проводить исследования новых механизмов заболевания, таких как токсичность пептида РАН. Черви предлагают несколько уникальных экспериментальных атрибутов, которые в настоящее время не доступны в других моделях пептидной токсичности RAN. Во-первых, C. elegans оптически прозрачны от рождения до смерти. Это позволяет просто визуализировать экспрессию и локализацию пептида РАН, а также анализ нейродегенерации у живых животных. Во-вторых, трансгенные методы генерации моделей экспрессии пептида РАН являются недорогими и быстрыми. Учитывая короткий трехдневный жизненный цикл C. elegans, стабильные трансгенные линии, выражающие любой пептид РАН в клеточном типе специфическим образом, могут быть произведены менее чем за неделю. В-третьих, простые фенотипические выходы могут сочетаться с методами генетического скрининга, такими как химический мутагенез или скрининг РНК, чтобы быстро определить гены, необходимые для токсичности пептида РАН. Наконец, короткая продолжительность жизни C. elegans (20 дней) позволяет следователям определить, как старение, которое является наибольшим фактором риска для большинства повторных заболеваний расширения, влияет на токсичность пептида РАН. В совокупности это сочетание экспериментальных атрибутов не имеет себе равных ни в одной другой модельной системе и предлагает мощную платформу для изучения токсичности пептида РАН.
Здесь мы описываем несколько анализов, которые используют экспериментальные преимущества C. elegans для измерения токсичности пептидов РАН и для выявления генетических модификаторов этой токсичности. Кодон-разнообразные ПЕПтиды ПО РАН помечены GFP и выражается индивидуально в любом мышечных клетках под промоутером мио-3 или в ГАМК-моторных нейронов под unc-47 промоутер. Для экспрессии в мышечных клетках, важно, чтобы токсичные пептиды RAN помечены зеленым флуоресцентным белком (GFP), или другим флуоресцентным белком (FP) тегом, который может быть направлен с вектором кормления РНК. Это потому, что токсичные экспрессии пептида RAN обычно блокирует рост, что делает такие штаммы нежизнеспособными. Использование gfp (RNAi) условно инактивирует экспрессию пептида RAN и позволяет проводить поддерживающие деформации, генетические кресты и т.д. Для анализов, эти животные удаляются из gfp (RNAi), что позволяет выражение пептида РАН и в результате фенотипов. В дополнение к молекулярной стратегии для проектирования кодон-разнообразных конструкций экспрессии RAN пептида, мы описываем анализы для измерения токсичности развития (личиальная подвижность и анализ роста), пост-развития возрастной токсичности (парализующий анализ), и нейронных морфологических дефектов (анализ commissure).
Здесь мы сообщаем методы, которые могут быть использованы для ассеидного токсичности пептида RAN, смоделированных в мышцах или в нейронах C. elegans. В то время как нейродегенеративные белки имеют возрастной фенотип у пациентов с людьми, они также могут проявлять развитие токсичности, к…
The authors have nothing to disclose.
NIH R21NS107797
35mm x 10mm Petri Dish, Sterile | CELLTREAT Scientific Products | 50-202-036 | Nematode growth plates and RNAi |
AGAR GRANULATED 2KILOGRAM | BD DIAGNOSTIC SYSTEMS | DF0145070 | Nematode growth plates and RNAi |
AGAROSE ULTRAPURE | LIFE TECHNOLOGIES | 16500500 | Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains |
CARBENICILLIN 5G | THERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALS | BP26485 | Nematode growth plates and RNAi |
COVER GLASSES NO 1 22MM 1OZ/PK | THERMO SCI ERIE | 12542B | Imaging for commissure assay |
FEMOTIPS DISPSBL MICROINJ 20CS | EPPENDORF NORTH AMERICA BIOTOOLS | E5242952008 | Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains |
FF COV GLASS NO1 40X22MM 1OZPK | THERMO SCI ERIE | 125485C | Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains |
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | THERMO SCI ERIE | 12-550-15 | Imaging for commissure assay |
Gibco Bacto Peptone | Gibco | DF0118-17-0 | Nematode growth plates and RNAi |
HALOCARBON OIL 700 | SIGMA-ALDRICH INC | H8898-50ML | Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains |
IPTG BIOTECH 10G | THERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALS | BP162010 | Nematode growth plates and RNAi |
Leica Advanced Fluorescence imaging software | Leica Microsystems | LAS-AF | Image acquisition software for video speed analysis and commissure assay |
Leica Immersion type N (Oil) | W NUHSBAUM INC | NC9547002 | Imaging for commissure assay |
LEVAMISOLE HYDROCHLORIDE 10GR | THERMO SCI ACROS ORGANICS | AC187870100 | Imaging for commissure assay |
MICROLOADER TIPS 2 X 96 PCS | EPPENDORF NORTH AMERICA BIOTOOLS | E5242956003 | Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains |
PETRI DISH, 60X15MM,500/CS |
CORNING LIFE SCIENCES PLASTIC | FB0875713A | Nematode growth plates and RNAi |
TISSUE CULT PLATE 24WEL 50/CS | CORNING LIFE SCIENCES DL | 87721 | Nematode growth plates and RNAi |