外科用マウスモデルにおける変形性関節症の標準化組織形態評価
1Center for Orthopedic Research and Translational Sciences, Department of Orthopedics and Rehabilitation,Pennsylvania State College of Medicine, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology,Pennsylvania State College of Medicine, 3Department of Pharmacology,Pennsylvania State College of Medicine
Summary
現在のプロトコルは変形性関節症に伴う形態学的関節変化の定量化のための厳密で再現可能な方法を確立する。このプロトコルの適用は、疾患の進行を監視し、変形性関節症における治療介入を評価する上で価値がある。
Abstract
米国で最も流行している関節疾患の1つである変形性関節症(OA)は、関節軟骨の進行性変性を特徴とし、主に股関節および膝関節において、患者の移動性および生活の質に大きな影響を及ぼす。現在までに、軟骨変性を遅くまたは阻害することができるOAのための既存の治癒療法はありません。現在、OA病理を理解し、OAを効率的に減速、停止、または逆転させることができる新しい治療アプローチまたは薬剤を発見するための広範な研究機関があります。したがって、関節軟骨、滑膜、軟骨下骨のOA関連の病理学的変化を正確に評価するために、定量的かつ再現可能なアプローチを持つことは非常に重要です。現在、OAの重症度と進行は、主に変形性関節症研究協会インターナショナル(OARSI)またはマンキンスコアリングシステムを使用して評価されています。これらのスコアリングシステムの重要性にもかかわらず、半定量的であり、ユーザーの主観性の影響を受ける可能性があります。さらに重要なことは、初期の疾患状態または早期治療段階における軟骨の微妙な、まだ重要な変化を正確に評価できないことである。ここで説明するプロトコルは、コンピュータ化された半自動化された組織形態測定ソフトウェアシステムを使用して、OAにおける関節変化の評価のための標準化された厳格で再現可能な定量的方法論を確立します。このプロトコルは既存のシステムに強力な付加を提示し、継手の病理学的変化のより効率的な検出を可能にする。
Introduction
米国で最も流行している関節障害の1つであるOAは、関節軟骨の進行性変性を特徴とし、主に股関節および膝関節において、患者の移動性および生活の質に大きな影響を及ぼす1,1、2、3。32関節軟骨は、摩擦を最小限に抑え、動きを容易にし、関節圧迫4に耐えるように設計された、ジ関節関節の特殊な結合組織である。関節軟骨は、軟骨細胞と細胞外マトリックスの2つの主要成分で構成されています。軟骨細胞は、細胞外マトリックス4の開発、維持、修復において主要な役割を果たす特殊な代謝活性細胞である。軟骨肥大(CH)は、OAの開発の主要な病理学的徴候の一つである。細胞サイズの増加、プロテオグリカン産生の減少、および最終的に軟骨変性55、6、76,7につながる軟骨マトリックス分解酵素の産生増加を特徴とする。また、関節の軟骨下骨および滑膜の病的変化は、OAの発達および進行898、9、10、11、1210,11において重要な役割を12果たす。,現在までに,、軟骨変性1、2、3、13、142,3,13を阻害する既存の治癒療法はありません。114したがって、OA病理を理解し、OAを遅くしたり停止したりすることができる新しい治療アプローチを発見することを目的とした広範な進行中の研究があります。したがって、関節の軟骨、滑膜、および軟骨下骨におけるOA関連の病理学的変化を正確に評価できる定量的かつ再現性のあるアプローチの必要性が高まっています。
現在、OAの重症度と進行は、主にOARSIまたはマンキンスコアリングシステム15を使用して評価される。しかし、これらのスコアリングシステムは半定量的なものであり、ユーザーの主観性の影響を受ける可能性があります。さらに重要なことは、疾患の間、または遺伝子操作または治療介入に応答して関節に起こる微妙な変化を正確に評価できないことである。軟骨、滑膜、または軟骨下骨,,16、17、18、19、20、2117の組織形態測定分析を記述する16文献には散発的な報告がある。19,20,2118しかし、これらの関節成分の厳密かつ再現性のある組織形態分析のための詳細なプロトコルはまだ欠けており、現場で満たされていないニーズを生み出しています。
組織形態測定解析を用いたOAの病理学的変化を研究するために、手術用OAマウスモデルを用いて、内側半月板(DMM)の不安定化を介してOAを誘導した。マウスOAの確立されたモデルの中で、 DMM は傷害の外傷性メカニズムを含むため、我々の研究のために選択されました22,,23,,24,,25, 26.,26半月靭帯損傷(MLI)または前十字靭帯損傷(ACLI)手術と比較して、DMMは、ヒト,22、24、25、26,24,におけるOAの発達と同様に、OAのより緩やかな進行を促進する。25マウスは、関節軟骨、軟骨下骨、および滑膜の変化を評価するためにDMM手術後12週間で安楽死させた。
このプロトコルの目的は、OA に伴う共同変更を評価するための、標準化された厳格で定量的なアプローチを確立することです。
Protocol
12週齢の雄C57BL/6マウスはJax Labsから購入した。すべてのマウスは、12時間の明暗スケジュールの部屋で、マイクロアイソレーターケージあたり3〜5匹のマウスのグループに収容された。すべての動物の手順は、国立衛生研究所(NIH)実験動物のケアと使用のためのガイドに従って行われ、ペンシルベニア州立大学動物ケアと使用委員会によって承認されました。 1. 心的?…
Representative Results
DMM誘導OAは関節軟骨変性と軟骨細胞損失をもたらすDMM誘導OAは、偽マウスと比較してOARSIスコアが増加し、表面浸食および軟骨損失によって明らかに特徴づけられた(図1A、D)。Dここで詳述したヒストモルホメトリープロトコルは、総軟骨面積の減少および非定量化軟骨領域(図1A、B、E、G)を含むいくつかのOA関連のB変化をE</str…
Discussion
最近の変形性関節症研究は、関節内の異なる組織と、各組織が疾患開始または進行において果たす役割の間のクロストークの理解を高めている898、9、10、35、36。10,35,36,したがって、OAの評価は軟骨の分析に限定されるべきではなく、軟骨下骨および滑膜の分析も含める?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、ペンステートミルトンS.ハーシー医療センターの比較医学部門のスタッフと分子および組織病理学コアの支援を認めたいと思います。資金源:NIH NIAMS 1RO1AR071968-01A1(F.K.)、ANRF関節炎研究助成金(F.K.)。
Materials
| 10% Buffered Formalin Phosphate | Fisher Chemical | SF100-20 | For sample fixation following harvest |
| Acetic Acid, Glacial (Certified A.C.S.) | Fisher Chemical | A38S-212 | For Decalcification Buffer preparation and acetic acid solution preparation for staining |
| Cintiq 27QHD Creative Pen Display | Wacom | https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch | For histomorphometric analysis and imaging |
| Cintiq Ergo stand | Wacom | https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch | For histomorphometric analysis and imaging |
| Ethylenediaminetetraacetic acid, tetrasodium salt dihydrate, 99% | Acros Organics | AC446080010 | For Decalcification Buffer preparation |
| Fast Green stain | SIGMA Life Sciences | F7258 | For sample staining |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher | 12-550-15 | For sample section collection |
| HistoPrep Xylene | Fisherbrand | HC-700-1GAL | For sample deparrafinization and staining |
| Histosette II Tissue Cassettes – Combination Lid and Base | Fisher | 15-182-701A | For sample processing and embedding |
| HP Z440 Workstation | HP | Product number: Y5C77US#ABA | For histomorphometric analysis and imaging |
| Manual Rotary Microtome | Leica | RM 2235 | For sample sectioning |
| Marking pens | Leica | 3801880 | For sample labeling, cassettes and slides |
| OLYMPUS BX53 Microscope | OLYMPUS | https://www.olympus-lifescience.com/en/microscopes/upright/bx53f2/ | For histomorphometric analysis and imaging |
| OLYMPUS DP 73 Microscope Camera | OLYMPUS | https://www.olympus-lifescience.com/en/camera/color/dp73/ | For histomorphometric analysis and imaging (discontinued) |
| ORION STAR A211 pH meter | Thermo Scientific | STARA2110 | For Decalcification Buffer preparation |
| OsteoMeasure Software | OsteoMetrics | https://www.osteometrics.com/index.htm | For histomorphometric measurement and analysis |
| Perfusion Two Automated Pressure Perfusion system | Leica | Model # 39471005 | For mouse knee harvest |
| PRISM 7 Software | GraphPad | Institutional Access Account | Statistical Analysis |
| Safranin-O stain | SIGMA Life Sciences | S8884 | For sample staining |
| ThinkBoneStage – Rotating Microscope Stage | Think Bone Consulting Inc. – OsteoMetrics (supplier) | http://thinkboneconsulting.com/index_files/Slideholder.php | For histomorphometric analysis and imaging |
| Wacom Pro Pen Stylus | Wacom | https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch | For histomorphometric analysis and imaging |
| Weigerts Iron Hematoxylin A | Fisher | 5029713 | For hematoxylin staining |
| Weigerts Iron Hematoxylin B | Fisher | 5029714 | For hematoxylin staining |
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Cite This Article
Pinamont, W. J., Yoshioka, N. K., Young, G. M., Karuppagounder, V., Carlson, E. L., Ahmad, A., Elbarbary, R., Kamal, F. Standardized Histomorphometric Evaluation of Osteoarthritis in a Surgical Mouse Model. J. Vis. Exp. (159), e60991, doi:10.3791/60991 (2020).