Standardisierte histomorphometrische Bewertung von Osteoarthritis in einem chirurgischen Mausmodell
Summary
Das aktuelle Protokoll legt eine strenge und reproduzierbare Methode zur Quantifizierung morphologischer Gelenkveränderungen fest, die mit Arthrose einhergehen. Die Anwendung dieses Protokolls kann bei der Überwachung des Krankheitsverlaufs und der Bewertung therapeutischer Interventionen bei Arthrose von Nutzen sein.
Abstract
Eine der häufigsten Gelenkerkrankungen in den Vereinigten Staaten, Arthrose (OA) ist durch fortschreitende Degeneration des Gelenkknorpels gekennzeichnet, vor allem in den Hüft- und Kniegelenken, was zu signifikanten Auswirkungen auf die Mobilität des Patienten und die Lebensqualität führt. Bis heute gibt es keine heilenden Therapien für OA, die in der Lage sind, die Knorpeldegeneration zu verlangsamen oder zu hemmen. Derzeit gibt es eine umfangreiche Reihe von laufenden Forschungen, um OA-Pathologie zu verstehen und neue therapeutische Ansätze oder Wirkstoffe zu entdecken, die OA effizient verlangsamen, stoppen oder sogar umkehren können. Daher ist es entscheidend, einen quantitativen und reproduzierbaren Ansatz zu haben, um OA-assoziierte pathologische Veränderungen im Gelenkknorpel, Synovium und subchondralen Knochen genau zu bewerten. Derzeit, OA Schweregrad und Progression werden in erster Linie mit der Osteoarthritis Research Society International (OARSI) oder Mankin Scoring Systeme bewertet. Trotz der Bedeutung dieser Bewertungssysteme sind sie semiquantitativ und können durch die Subjektivität des Benutzers beeinflusst werden. Noch wichtiger ist, dass sie es nicht schaffen, subtile, aber wichtige Veränderungen im Knorpel während der frühen Krankheitszustände oder frühen Behandlungsphasen genau zu bewerten. Das Protokoll, das wir hier beschreiben, verwendet ein computergestütztes und halbautomatisiertes histomorphometrisches Softwaresystem, um eine standardisierte, strenge und reproduzierbare quantitative Methodik für die Bewertung gemeinsamer Veränderungen in OA zu etablieren. Dieses Protokoll stellt eine leistungsstarke Ergänzung der bestehenden Systeme dar und ermöglicht eine effizientere Erkennung pathologischer Veränderungen im Gelenk.
Introduction
Eine der häufigsten Gelenkerkrankungen in den Vereinigten Staaten, OA ist durch fortschreitende Degeneration des Gelenkknorpels gekennzeichnet, vor allem in den Hüft- und Kniegelenken, was zu signifikanten Auswirkungen auf die Patientenmobilität und Lebensqualität1,2,3. Gelenkknorpel ist das spezialisierte Bindegewebe von Diarthrodialgelenken entwickelt, um Reibung zu minimieren, Bewegung zu erleichtern, und Gelenkkompressionaushalten 4. Gelenkknorpel besteht aus zwei Hauptkomponenten: Chondrozyten und extrazelluläre Matrix. Chondrozyten sind spezialisierte, metabolisch aktive Zellen, die eine primäre Rolle bei der Entwicklung, Wartung und Reparatur der extrazellulären Matrix4spielen. Chondrozytenhypertrophie (CH) ist eines der wichtigsten pathologischen Zeichen der OA-Entwicklung. Es zeichnet sich durch erhöhte Zellgröße, verminderte Proteoglykan-Produktion und erhöhte Produktion von Knorpelmatrix-abbauenden Enzymen aus, die schließlich zu Knorpeldegeneration5,6,7führen. Weiterhin spielen pathologische Veränderungen des subchondralen Knochens und des Synoviums des Gelenks eine wichtige Rolle bei der Entwicklung und Progression der OA8,9,10,11,12. Bis heute gibt es keine heilenden Therapien, die Knorpeldegeneration1,2,3,13,14hemmen. So gibt es umfangreiche laufende Forschung, die darauf abzielt, OA Pathologie zu verstehen und neue therapeutische Ansätze zu entdecken, die in der Lage sind, zu verlangsamen oder sogar zu stoppen OA. Dementsprechend besteht ein zunehmender Bedarf an einem quantitativen und reproduzierbaren Ansatz, der eine genaue Bewertung der OA-assoziierten pathologischen Veränderungen im Knorpel, Synovium und subchondralen Knochen des Gelenks ermöglicht.
Derzeit werden OA Schweregrad und Progression in erster Linie mit den OARSI oder Mankin Scoring-Systemen15bewertet. Diese Bewertungssysteme sind jedoch nur semiquantitativ und können durch die Subjektivität des Benutzers beeinflusst werden. Noch wichtiger ist, dass sie es versäumen, subtile Veränderungen, die während der Krankheit oder als Reaktion auf genetische Manipulation oder eine therapeutische Intervention auftreten, genau zu bewerten. Es gibt sporadische Berichte in der Literatur, die histomorphometrische Analysen des Knorpels, Synoviums oder subchondralen Knochens16,17,18,19,20,21beschreiben. Ein detailliertes Protokoll für eine rigorose und reproduzierbare histomorphometrische Analyse all dieser Gelenkkomponenten fehlt jedoch noch, was einen unerfüllten Bedarf vor Ort erzeugt.
Um pathologische Veränderungen in OA mit hilfe histomorphometrischer Analyse zu untersuchen, verwendeten wir ein chirurgisches OA-Mausmodell, um OA durch Destabilisierung des medialen Meniskus (DMM) zu induzieren. Unter den etablierten Modellen der murinen OA, DMM wurde für unsere Studie ausgewählt, weil es einen weniger traumatischen Mechanismus der Verletzung22,23,24,25,26umfasst. Im Vergleich zu Meniskal-Bänderverletzungen (MLI) oder vorderen Kreuzbandverletzungen (ACLI) fördert DMM eine allmählichere Progression von OA, ähnlich der OA-Entwicklung beim Menschen22,24,25,26. Mäuse wurden zwölf Wochen nach der DMM-Operation eingeschläfert, um Veränderungen im Gelenkknorpel, subchondralen Knochen und Synovium zu bewerten.
Ziel dieses Protokolls ist es, einen standardisierten, strengen und quantitativen Ansatz zur Bewertung gemeinsamer Änderungen zu etablieren, die OA begleiten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Jüngste Arthrose Forschung hat unser Verständnis des Crosstalk zwischen den verschiedenen Geweben innerhalb des Gelenks und die Rolle jedes Gewebes bei der Krankheitseinleitung oder Progression8,9,10,35,36verbessert. Daher ist es offensichtlich geworden, dass sich die Bewertung von OA nicht auf die Analyse des Knorpels beschränken sollte, sondern auch die A…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir möchten die Unterstützung des Personals der Abteilung für Vergleichende Medizin und des Kerns der Molekular- und Histopathologie am Penn State Milton S. Hershey Medical Center würdigen. Finanzierungsquellen: NIH NIAMS 1RO1AR071968-01A1 (F.K.), ANRF Arthritis Research Grant (F.K.).
Materials
| 10% Buffered Formalin Phosphate | Fisher Chemical | SF100-20 | For sample fixation following harvest |
| Acetic Acid, Glacial (Certified A.C.S.) | Fisher Chemical | A38S-212 | For Decalcification Buffer preparation and acetic acid solution preparation for staining |
| Cintiq 27QHD Creative Pen Display | Wacom | https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch | For histomorphometric analysis and imaging |
| Cintiq Ergo stand | Wacom | https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch | For histomorphometric analysis and imaging |
| Ethylenediaminetetraacetic acid, tetrasodium salt dihydrate, 99% | Acros Organics | AC446080010 | For Decalcification Buffer preparation |
| Fast Green stain | SIGMA Life Sciences | F7258 | For sample staining |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher | 12-550-15 | For sample section collection |
| HistoPrep Xylene | Fisherbrand | HC-700-1GAL | For sample deparrafinization and staining |
| Histosette II Tissue Cassettes – Combination Lid and Base | Fisher | 15-182-701A | For sample processing and embedding |
| HP Z440 Workstation | HP | Product number: Y5C77US#ABA | For histomorphometric analysis and imaging |
| Manual Rotary Microtome | Leica | RM 2235 | For sample sectioning |
| Marking pens | Leica | 3801880 | For sample labeling, cassettes and slides |
| OLYMPUS BX53 Microscope | OLYMPUS | https://www.olympus-lifescience.com/en/microscopes/upright/bx53f2/ | For histomorphometric analysis and imaging |
| OLYMPUS DP 73 Microscope Camera | OLYMPUS | https://www.olympus-lifescience.com/en/camera/color/dp73/ | For histomorphometric analysis and imaging (discontinued) |
| ORION STAR A211 pH meter | Thermo Scientific | STARA2110 | For Decalcification Buffer preparation |
| OsteoMeasure Software | OsteoMetrics | https://www.osteometrics.com/index.htm | For histomorphometric measurement and analysis |
| Perfusion Two Automated Pressure Perfusion system | Leica | Model # 39471005 | For mouse knee harvest |
| PRISM 7 Software | GraphPad | Institutional Access Account | Statistical Analysis |
| Safranin-O stain | SIGMA Life Sciences | S8884 | For sample staining |
| ThinkBoneStage – Rotating Microscope Stage | Think Bone Consulting Inc. – OsteoMetrics (supplier) | http://thinkboneconsulting.com/index_files/Slideholder.php | For histomorphometric analysis and imaging |
| Wacom Pro Pen Stylus | Wacom | https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch | For histomorphometric analysis and imaging |
| Weigerts Iron Hematoxylin A | Fisher | 5029713 | For hematoxylin staining |
| Weigerts Iron Hematoxylin B | Fisher | 5029714 | For hematoxylin staining |
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