Summary

Gestandaardiseerde Histomormetrische evaluatie van artrose in een chirurgisch muismodel

Published: May 06, 2020
doi:

Summary

Het huidige protocol stelt een rigoureuze en reproduceerbare methode voor kwantificering van morfologische gewrichtsveranderingen die gepaard gaan met artrose. Toepassing van dit protocol kan waardevol zijn bij het monitoren van ziekteprogressie en het evalueren van therapeutische interventies bij artrose.

Abstract

Een van de meest voorkomende gewrichtsaandoeningen in de Verenigde Staten, artrose (OA) wordt gekenmerkt door progressieve degeneratie van gewrichtskraakbeen, voornamelijk in de heup-en kniegewrichten, wat resulteert in aanzienlijke effecten op de mobiliteit van de patiënt en de kwaliteit van leven. Tot op heden zijn er geen bestaande curatieve therapieën voor OA in staat om te vertragen of te remmen kraakbeen degeneratie. Momenteel is er een uitgebreid lichaam van lopend onderzoek om OA-pathologie te begrijpen en nieuwe therapeutische benaderingen of middelen te ontdekken die efficiënt kunnen vertragen, stoppen of zelfs OA kunnen omkeren. Het is dus van cruciaal belang om een kwantitatieve en reproduceerbare benadering te hebben om oa-geassocieerde pathologische veranderingen in het gewrichtskraakbeen, synovium en subchondrale bot nauwkeurig te evalueren. Momenteel, OA ernst en progressie worden voornamelijk beoordeeld met behulp van de Artrose Research Society International (OARSI) of Mankin scoren systemen. Ondanks het belang van deze scoresystemen zijn ze semikwantitatief en kunnen ze worden beïnvloed door de subjectiviteit van de gebruiker. Wat nog belangrijker is, ze niet nauwkeurig te evalueren subtiele, maar toch belangrijk, veranderingen in het kraakbeen tijdens de vroege ziekte staten of vroege behandelingsfasen. Het protocol dat we hier beschrijven maakt gebruik van een geautomatiseerd en semigeautomatiseerd histomorfometrisch softwaresysteem om een gestandaardiseerde, rigoureuze en reproduceerbare kwantitatieve methodologie vast te stellen voor de evaluatie van gezamenlijke veranderingen in OA. Dit protocol biedt een krachtige aanvulling op de bestaande systemen en zorgt voor een efficiëntere detectie van pathologische veranderingen in het gewricht.

Introduction

Een van de meest voorkomende gewrichtsaandoeningen in de Verenigde Staten, OA wordt gekenmerkt door progressieve degeneratie van gewrichtskraakbeen, voornamelijk in de heup-en kniegewrichten, wat resulteert in aanzienlijke effecten op de mobiliteit van de patiënt en de kwaliteit van leven1,2,3. Gewrichtskraakbeen is het gespecialiseerde bindweefsel van diarthrodiale gewrichten ontworpen om wrijving te minimaliseren, beweging te vergemakkelijken en gewrichtscompressie te verdragen4. Gewrichtskraakbeen bestaat uit twee primaire componenten: chondrocyten en extracellulaire matrix. Chondrocyten zijn gespecialiseerde, metabolisch actieve cellen die een primaire rol spelen in de ontwikkeling, het onderhoud en de reparatie van de extracellulaire matrix4. Chondrocyte hypertrofie (CH) is een van de belangrijkste pathologische tekenen van OA-ontwikkeling. Het wordt gekenmerkt door een verhoogde cellulaire grootte, verminderde proteoglycan productie, en verhoogde productie van kraakbeen matrix-vernederende enzymen die uiteindelijk leiden tot kraakbeen degeneratie5,6,7. Verder spelen pathologische veranderingen in het subchondal bot en synovium van het gewricht een belangrijke rol in oa-ontwikkeling en progressie8,9,10,11,12. Tot op heden zijn er geen bestaande curatieve therapieën diekraakbeendegeneratie1,2,3,13,14remmen . Zo is er uitgebreid lopend onderzoek dat tot doel heeft oa-pathologie te begrijpen en nieuwe therapeutische benaderingen te ontdekken die in staat zijn om OA te vertragen of zelfs te stoppen. Daarom is er een toenemende behoefte aan een kwantitatieve en reproduceerbare aanpak die een nauwkeurige evaluatie van oa-geassocieerde pathologische veranderingen in het kraakbeen, synovium en subchondrale bot van het gewricht mogelijk maakt.

Momenteel worden oa ernst en progressie voornamelijk beoordeeld met behulp van de OARSI of Mankin scoring systems15. Deze scoresystemen zijn echter slechts semikwantitatief en kunnen worden beïnvloed door de subjectiviteit van de gebruiker. Wat nog belangrijker is, ze niet nauwkeurig te evalueren subtiele veranderingen die zich voordoen in het gewricht tijdens de ziekte of in reactie op genetische manipulatie of een therapeutische interventie. Er zijn sporadische rapporten in de literatuur die histomorfometrische analyses van het kraakbeen, synovium, of subchondralbot16,17,18,19,,,20,21beschrijven . Een gedetailleerd protocol voor een rigoureuze en reproduceerbare histomorfometrische analyse van al deze gemeenschappelijke componenten ontbreekt echter nog steeds, waardoor een onvervulde behoefte in het veld ontstaat.

Om pathologische veranderingen in OA te bestuderen met histomorfometrische analyse, gebruikten we een chirurgisch OA-muismodel om OA te induceren via destabilisatie van de mediale meniscus (DMM). Onder de gevestigde modellen van murine OA, DMM werd geselecteerd voor onze studie, omdat het gaat om een minder traumatisch mechanisme van letsel22,23,24,25,26. In vergelijking met meniscal-ligamenteuze letsel (MLI) of voorste kruisbandletsel (ACLI) operaties, DMM bevordert een meer geleidelijke progressie van OA, vergelijkbaar met OA ontwikkeling bij de mens22,24,25,26. Muizen werden twaalf weken na de DMM-operatie geëuthanaseerd om veranderingen in het gewrichtskraakbeen, subchondrale bot en synovium te evalueren.

Het doel van dit protocol is om een gestandaardiseerde, rigoureuze en kwantitatieve aanpak vast te stellen om gezamenlijke veranderingen te evalueren die oa vergezellen.

Protocol

Twaalf weken oude mannelijke C57BL/6 muizen werden gekocht bij Jax Labs. Alle muizen werden gehuisvest in groepen van 3-5 muizen per micro-isolator kooi in een kamer met een 12 uur licht / donker schema. Alle dierlijke procedures werden uitgevoerd volgens de National Institute of Health (NIH) Guide for the Care and Use of Laboratory Animals en goedgekeurd door het Animal Care and Use Committee van Pennsylvania State University. 1. Posttraumatische artrose (PTOA) chirurgisch model <o…

Representative Results

DMM-geïnduceerde OA resulteert in gewrichtskraakbeendegeneratie en chondrocyteverliesDMM-geïnduceerde OA resulteerde in een verhoogde OARSI score in vergelijking met sham muizen, duidelijk gekenmerkt door oppervlakteerosie en kraakbeenverlies (Figuur 1A,D). Het hier beschreven histomorfometrieprotocol heeft verschillende oa-geassocieerde veranderingen gedetecteerd, waaronder een afname van het totale kraakbeenareaal en in het ongecalcificeerde kraakbee…

Discussion

Recent onderzoek naar artrose heeft ons begrip van de kruisbestuiving tussen de verschillende weefsels in het gewricht en de rol die elk weefsel speelt bij het initiëren van de ziekte of progressie8,,9,10,35,36. Het is dan ook duidelijk geworden dat de beoordeling van OA niet beperkt moet blijven tot de analyse van het kraakbeen, maar ook een analyse van het …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We willen graag de hulp erkennen van het departement vergelijkende geneeskunde personeel en de moleculaire en histopathologie kern in Penn State Milton S. Hershey Medical Center. Financieringsbronnen: NIH NIAMS 1RO1AR071968-01A1 (F.K.), ANRF Artritis Research Grant (F.K.).

Materials

10% Buffered Formalin Phosphate Fisher Chemical SF100-20 For sample fixation following harvest
Acetic Acid, Glacial (Certified A.C.S.) Fisher Chemical A38S-212 For Decalcification Buffer preparation and acetic acid solution preparation for staining
Cintiq 27QHD Creative Pen Display Wacom https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch For histomorphometric analysis and imaging
Cintiq Ergo stand Wacom https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch For histomorphometric analysis and imaging
Ethylenediaminetetraacetic acid, tetrasodium salt dihydrate, 99% Acros Organics AC446080010 For Decalcification Buffer preparation
Fast Green stain SIGMA Life Sciences F7258 For sample staining
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides Fisher 12-550-15 For sample section collection
HistoPrep Xylene Fisherbrand HC-700-1GAL For sample deparrafinization and staining
Histosette II Tissue Cassettes – Combination Lid and Base Fisher 15-182-701A For sample processing and embedding
HP Z440 Workstation HP Product number: Y5C77US#ABA For histomorphometric analysis and imaging
Manual Rotary Microtome Leica RM 2235 For sample sectioning
Marking pens Leica 3801880 For sample labeling, cassettes and slides
OLYMPUS BX53 Microscope OLYMPUS https://www.olympus-lifescience.com/en/microscopes/upright/bx53f2/ For histomorphometric analysis and imaging
OLYMPUS DP 73 Microscope Camera OLYMPUS https://www.olympus-lifescience.com/en/camera/color/dp73/ For histomorphometric analysis and imaging (discontinued)
ORION STAR A211 pH meter Thermo Scientific STARA2110 For Decalcification Buffer preparation
OsteoMeasure Software OsteoMetrics https://www.osteometrics.com/index.htm For histomorphometric measurement and analysis
Perfusion Two Automated Pressure Perfusion system Leica Model # 39471005 For mouse knee harvest
PRISM 7 Software GraphPad Institutional Access Account Statistical Analysis
Safranin-O stain SIGMA Life Sciences S8884 For sample staining
ThinkBoneStage – Rotating Microscope Stage Think Bone Consulting Inc. – OsteoMetrics (supplier) http://thinkboneconsulting.com/index_files/Slideholder.php For histomorphometric analysis and imaging
Wacom Pro Pen Stylus Wacom https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch For histomorphometric analysis and imaging
Weigerts Iron Hematoxylin A Fisher 5029713 For hematoxylin staining
Weigerts Iron Hematoxylin B Fisher 5029714 For hematoxylin staining

References

  1. Ma, V. Y., Chan, L., Carruthers, K. J. Incidence, prevalence, costs, and impact on disability of common conditions requiring rehabilitation in the United States: stroke, spinal cord injury, traumatic brain injury, multiple sclerosis, osteoarthritis, rheumatoid arthritis, limb loss, and back pain. Archives of Physical Medicine and Rehabililation. 95 (5), 986-995 (2014).
  2. Hopman, W., et al. Associations between chronic disease, age and physical and mental health status. Journal of Chronic Diseases in Canada. 29 (3), 108-116 (2009).
  3. Lorenz, J., Grässel, S., Singh, S., Coppola, V. Experimental osteoarthritis models in mice. Mouse Genetics. Methods in Molecular Biology. 1194, 401-419 (2004).
  4. Sophia Fox, A. J., Bedi, A., Rodeo, S. A. The basic science of articular cartilage: structure, composition, and function. Journal of Sports Health. 1 (6), 461-468 (2009).
  5. Van der Kraan, P., Van den Berg, W. Chondrocyte hypertrophy and osteoarthritis: role in initiation and progression of cartilage degeneration. Osteoarthritis and Cartilage. 20 (3), 223-232 (2012).
  6. Hodsman, A. B., et al. Parathyroid hormone and teriparatide for the treatment of osteoporosis: a review of the evidence and suggested guidelines for its use. Endocrine Reviews. 26 (5), 688-703 (2005).
  7. Pitsillides, A. A., Beier, F. Cartilage biology in osteoarthritis-lessons from developmental biology. Nature Reviews Rheumatology. 7 (11), 654 (2011).
  8. Yuan, X., et al. Bone-cartilage interface crosstalk in osteoarthritis: potential pathways and future therapeutic strategies. Osteoarthritis and Cartilage. 22 (8), 1077-1089 (2014).
  9. Goldring, S. R., Goldring, M. B. Changes in the osteochondral unit during osteoarthritis: structure, function and cartilage-bone crosstalk. Nature Reviews Rheumatology. 12 (11), 632 (2016).
  10. Martel-Pelletier, J., et al. Osteoarthritis. Nature Reviews Disease Primers. 2 (1), 16072 (2016).
  11. Goldring, M. B., Otero, M. Inflammation in osteoarthritis. Current Opinion in Rheumatology. 23 (5), 471 (2011).
  12. Sellam, J., Berenbaum, F. The role of synovitis in pathophysiology and clinical symptoms of osteoarthritis. Nature Reviews Rheumatology. 6 (11), 625 (2010).
  13. Ma, H., et al. Osteoarthritis severity is sex dependent in a surgical mouse model. Osteoarthritis and Cartilage. 15 (6), 695-700 (2007).
  14. Katon, W., Lin, E. H., Kroenke, K. The association of depression and anxiety with medical symptom burden in patients with chronic medical illness. General Hospital Psychiatry. 29 (2), 147-155 (2007).
  15. Glasson, S., Chambers, M., Van Den Berg, W., Little, C. The OARSI histopathology initiative-recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the mouse. Osteoarthritis and Cartilage. 18, 17-23 (2010).
  16. Pastoureau, P., Leduc, S., Chomel, A., De Ceuninck, F. Quantitative assessment of articular cartilage and subchondral bone histology in the meniscectomized guinea pig model of osteoarthritis. Osteoarthritis and Cartilage. 11 (6), 412-423 (2003).
  17. O’Driscoll, S. W., Marx, R. G., Fitzsimmons, J. S., Beaton, D. E. Method for automated cartilage histomorphometry. Tissue Engineering. 5 (1), 13-23 (1999).
  18. Matsui, H., Shimizu, M., Tsuji, H. Cartilage and subchondral bone interaction in osteoarthrosis of human knee joint: a histological and histomorphometric study. Microscopy Research Technique. 37 (4), 333-342 (1997).
  19. Hacker, S. A., Healey, R. M., Yoshioka, M., Coutts, R. D. A methodology for the quantitative assessment of articular cartilage histomorphometry. Osteoarthritis and Cartilage. 5 (5), 343-355 (1997).
  20. Pastoureau, P., Chomel, A., DeCeuninck, F., Sabatini, M., Pastoureau, P. Methods for Cartilage and Subchondral Bone Histomorphometry. Cartilage and Osteoarthritis. Methods in Molecular Medicine. 101, 79-91 (2004).
  21. McNulty, M. A., et al. A comprehensive histological assessment of osteoarthritis lesions in mice. Cartilage. 2 (4), 354-363 (2011).
  22. Glasson, S., Blanchet, T., Morris, E. The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse. Osteoarthritis and Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).
  23. Singh, S. R., Coppola, V. . Mouse Genetics: Methods and Protocols. , (2004).
  24. Fang, H., Beier, F. Mouse models of osteoarthritis: modelling risk factors and assessing outcomes. Nature Reviews Rheumatology. 10 (7), 413 (2014).
  25. Culley, K. L., Westendorf, J., van Wijnen, A., et al. Mouse Models of Osteoarthritis: Surgical Model of Posttraumatic Osteoarthritis Induced by Destabilization of the Medial Meniscus. Osteoporosis and Osteoarthritis. Methods in Molecular Biology. 1226, 143-173 (2015).
  26. Van der Kraan, P. Factors that influence outcome in experimental osteoarthritis. Osteoarthritis and Cartilage. 25 (3), 369-375 (2017).
  27. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
  28. Callis, G., Sterchi, D. Decalcification of bone: literature review and practical study of various decalcifying agents. Methods, and their effects on bone histology. Journal of Histotechnology. 21 (1), 49-58 (1998).
  29. Lajeunesse, D., Massicotte, F., Pelletier, J. P., Martel-Pelletier, J. Subchondral bone sclerosis in osteoarthritis: not just an innocent bystander. Modern Rheumatology. 13 (1), 0007-0014 (2003).
  30. Li, G., et al. Subchondral bone in osteoarthritis: insight into risk factors and microstructural changes. Arthritis Research Therapy. 15 (6), 223 (2013).
  31. Kapoor, M., Martel-Pelletier, J., Lajeunesse, D., Pelletier, J. P., Fahmi, H. Role of proinflammatory cytokines in the pathophysiology of osteoarthritis. Nature Reviews Rheumatology. 7 (1), 33 (2011).
  32. Scanzello, C. R., Goldring, S. R. The role of synovitis in osteoarthritis pathogenesis. Bone. 51 (2), 249-257 (2012).
  33. Benito, M. J., Veale, D. J., FitzGerald, O., van den Berg, W. B., Bresnihan, B. Synovial tissue inflammation in early and late osteoarthritis. Annals of the Rheumatic Diseases. 64 (9), 1263-1267 (2005).
  34. De Lange-Brokaar, B. J., et al. Synovial inflammation, immune cells and their cytokines in osteoarthritis: a review. Osteoarthritis and Cartilage. 20 (12), 1454-1499 (2012).
  35. Findlay, D. M., Kuliwaba, J. S. Bone-cartilage crosstalk: a conversation for understanding osteoarthritis. Bone Research. 4, 16028 (2016).
  36. Lories, R. J., Luyten, F. P. The bone-cartilage unit in osteoarthritis. Nature Reviews Rheumatology. 7 (1), 43 (2011).
  37. Pritzker, K. P., et al. Osteoarthritis cartilage histopathology: grading and staging. Journal of Osteoarthritis and Cartilage. 14 (1), 13-29 (2006).
  38. Hayami, T., et al. Characterization of articular cartilage and subchondral bone changes in the rat anterior cruciate ligament transection and meniscectomized models of osteoarthritis. Bone. 38 (2), 234-243 (2006).
  39. Priemel, M., et al. mineralization defects and vitamin D deficiency: Histomorphometric analysis of iliac crest bone biopsies and circulating 25-hydroxyvitamin D in 675 patients. Journal of Bone and Mineral Research. 25 (2), 305-312 (2010).
  40. Yukata, K., et al. Continuous infusion of PTH 1–34 delayed fracture healing in mice. Scientific Reports. 8 (1), 13175 (2018).
  41. Kawano, T., et al. LIM kinase 1 deficient mice have reduced bone mass. Bone. 52 (1), 70-82 (2013).
  42. Zhang, L., Chang, M., Beck, C. A., Schwarz, E. M., Boyce, B. F. Analysis of new bone, cartilage, and fibrosis tissue in healing murine allografts using whole slide imaging and a new automated histomorphometric algorithm. Bone Research. 4, 15037 (2016).
  43. Wu, Q., et al. Induction of an osteoarthritis-like phenotype and degradation of phosphorylated Smad3 by Smurf2 in transgenic mice. Arthritis Rheumatism. 58 (10), 3132-3144 (2008).
  44. Hordon, L., et al. Trabecular architecture in women and men of similar bone mass with and without vertebral fracture: I. Two-dimensional histology. Bone. 27 (2), 271-276 (2000).

Play Video

Cite This Article
Pinamont, W. J., Yoshioka, N. K., Young, G. M., Karuppagounder, V., Carlson, E. L., Ahmad, A., Elbarbary, R., Kamal, F. Standardized Histomorphometric Evaluation of Osteoarthritis in a Surgical Mouse Model. J. Vis. Exp. (159), e60991, doi:10.3791/60991 (2020).

View Video