JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Medicine

מתוקננת הערכה היסטראורמטרית של אוסטיאוארתריטיס במודל עכבר כירורגי

Published: May 06, 2020
doi:
10.3791/60991
, , , , , , ,
1Center for Orthopedic Research and Translational Sciences, Department of Orthopedics and Rehabilitation,Pennsylvania State College of Medicine, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology,Pennsylvania State College of Medicine, 3Department of Pharmacology,Pennsylvania State College of Medicine

Summary

הפרוטוקול הנוכחי יוצר שיטה קפדנית ומתוכנות לכמת של שינויים מורפולוגיים המלווים אוסטיאוארתריטיס. יישום פרוטוקול זה יכול להיות בעל ערך בניטור התקדמות המחלה והערכת התערבויות טיפוליות אוסטיאוארתריטיס.

Abstract

אחת ההפרעות המשותפת הנפוצות ביותר בארצות הברית, אוסטיאוארתריטיס (OA) מאופיין על ידי ניוון פרוגרסיבי של סחוס משני, בעיקר הירך ואת המפרקים בברך, אשר התוצאה משפיע משמעותית על ניידות המטופל איכות החיים. עד כה, אין טיפולים מרפא קיימים עבור OA מסוגל להאט או לעכב ניוון הסחוס. כיום, יש גוף נרחב של מחקר מתמשך להבין פתולוגיה OA לגלות גישות טיפוליות הרומן או סוכנים שיכולים ביעילות להאט, לעצור, או אפילו הפוכה OA. לפיכך, חיוני לקבל גישה כמותית ומשובת להעריך במדויק שינויים פתולוגיים המשויכים OA הסחוס המפרק, synovium, ו subchondral bone. כיום, חומרת OA והתקדמות מוערך בעיקר באמצעות החברה מחקר אוסטיאוארתריטיס הבינלאומי (OARSI) או מנצ מערכות הניקוד. למרות החשיבות של מערכות הניקוד הללו, הן כמותיים למחצה ויכולות להיות מושפעות מסובייקטיביות של המשתמש. חשוב מכך, הם לא מצליחים להעריך במדויק מעודן, אך חשובות, שינויים בסחוס במהלך מצבי המחלה המוקדמים או שלבי הטיפול המוקדמים. הפרוטוקול שאנו מתארים כאן משתמש במערכת תוכנה ממוחשבת וחצי אוטומטית ליצירת מתודולוגיה כמותית מתוקננת ומחמירה להערכת שינויים משותפים ב OA. פרוטוקול זה מציג תוספת רבת עוצמה למערכות הקיימות ומאפשר זיהוי יעיל יותר של שינויים פתולוגיים במפרק.

Introduction

אחת ההפרעות המשותפת הנפוצות ביותר בארצות הברית, OA מאופיין על ידי ניוון פרוגרסיבי של סחוס משני, בעיקר הירך ואת מפרקי הברך, אשר תוצאות השפעות משמעותיות על ניידות המטופל איכות החיים1,2,3. סחוס מעבר העור הוא רקמת החיבור המקצועית של המפרקים diarthrodial נועד למזער את החיכוך, להקל על התנועה, ולסבול דחיסה משותפת4. הסחוס הראשי מורכב משני מרכיבים עיקריים: כונדרוציטים ו מטריקס מסחטות. כונדרוציטים הם התמחה, metabolically תאים פעילים המשחק תפקיד עיקרי בפיתוח, תחזוקה, ותיקון של מטריצה החילוץ4. היפרפרס כונדרוציטים (CH) הוא אחד הסימנים הפתולוגיים העיקריים של התפתחות OA. הוא מאופיין על ידי גודל הסלולר גדל, ירידה בייצור פרוטאוגליקן, וייצור מוגבר של אנזימים מכמטריקס משפיל הסחוס כי בסופו של דבר להוביל את ניוון הסחוס5,6,7. עוד, שינויים פתולוגיים בעצם subchondral ו synovium של משותף לשחק תפקיד חשוב בפיתוח OA התקדמות8,9,10,11,12. עד כה, אין טיפולים מרפא קיימים המעעכב את ניוון הסחוס1,2,3,13,14. לפיכך, יש מחקר מתמשך נרחב שמטרתו להבין מחלות OA ולגלות גישות טיפוליות הרומן כי הם מסוגלים להאט או אפילו לעצור OA. לפיכך, יש צורך הולך וגובר לגישה כמותית ומשתנה המאפשר הערכה מדויקת של שינויים פתולוגיים OA הקשורים הסחוס, synovium, ו subchondral bone של המפרק.

כיום, חומרת OA והתקדמות מוערך בעיקר באמצעות מערכות הניקוד OARSI או Mankin15. עם זאת, מערכות הניקוד הללו הן רק חצי כמותית ויכולות להיות מושפעות מסובייקטיביות משתמשים. חשוב מכך, הם נכשלים בהערכת מדויק של שינויים עדינים המתרחשים במפרק במהלך המחלה או בתגובה מניפולציה גנטית או התערבות טיפולית. ישנם דיווחים מאוד בספרות המתארת ניתוחים היסטומריים של הסחוס, סינובינום, או subchondral bone16,17,18,19,20,21. עם זאת, פרוטוקול מפורט לניתוח היסטראומטרי קפדני ומעמיק של כל הרכיבים המשותפים הללו עדיין חסר, ויוצר צורך בלתי מתקיים בתחום.

כדי ללמוד שינויים פתולוגיים ב OA באמצעות ניתוח histomorphometric, השתמשנו במודל העכבר OA כירורגית כדי לגרום OA באמצעות חוסר יציבות של מניסקוס המדילי (dmm). בין המודלים הקימו של מורנה OA, dmm נבחר עבור המחקר שלנו כי זה כרוך מנגנון פחות טראומטי של פציעה22,23,24,25,26. בהשוואה ל-meniscal-ligamentous פציעה (mli) או פציעה ברצועה הצולבת הקדמית (acli) ניתוחים, dmm מקדם התקדמות הדרגתית יותר של OA, דומה לפיתוח oa בבני אדם22,24,25,26. עכברים הורדמים 12 שבועות לאחר ניתוח DMM להערכת שינויים הסחוס הפרקולארית, subchondral bone, ו synovium.

המטרה של פרוטוקול זה היא ליצור גישה סטנדרטית, קפדנית וכמותית להערכת שינויים משותפים המלווים OA.

Protocol

בן שתים עשרה שבועות C57BL עכברים שנרכשו ממעבדות ג’אקס. כל העכברים שוכנו בקבוצות של 3 – 5 עכברים לכל כלוב מיקרו מבודדת בחדר עם לוח זמנים של 12 שעות אור/כהה. כל ההליכים בעלי חיים בוצעו על פי המדריך הלאומי לבריאות (NIH) מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה ואושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים והשתמ?…

Representative Results

DMM-המושרה תוצאות OA בניוון הסחוס הפרקולארית והפסד כונדרוציטוטOA המושרה DMM הביא לציון OARSI גדל לעומת עכברים מזויפים, מאופיין בבירור על ידי שחיקת פני השטח ואובדן הסחוס (איור 1A,D). פרוטוקול histomorphometry מפורט כאן זיהה כמה שינויים OA הקשורים, כולל ירידה באזור הסחוס ה…

Discussion

מחקר אוסטיאוארתריטיס האחרונות הגדילו את ההבנה שלנו של הוצלב בין הרקמות השונות בתוך המפרק ואת התפקיד כל רקמה משחק חניכה המחלה או התקדמות8,9,10,35,36. בהתאם, זה הפך ברור כי הערכה של OA לא צריך להיות מוגבל נית?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ברצוני להכיר בעזרתם של צוות המחלקה לרפואה השוואתית והליבה המולקולרית וההיסטולוגיה במרכז הרפואי פן מילטון ס. הרשי. מקורות מימון: NIH NIAMS 1RO1AR071968-01A1 (סיר f סאוויני), דלקת מפרקים אנRF מחקר מענק (סיר f סאוויני).

Materials

10% Buffered Formalin Phosphate Fisher Chemical SF100-20 For sample fixation following harvest
Acetic Acid, Glacial (Certified A.C.S.) Fisher Chemical A38S-212 For Decalcification Buffer preparation and acetic acid solution preparation for staining
Cintiq 27QHD Creative Pen Display Wacom https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch For histomorphometric analysis and imaging
Cintiq Ergo stand Wacom https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch For histomorphometric analysis and imaging
Ethylenediaminetetraacetic acid, tetrasodium salt dihydrate, 99% Acros Organics AC446080010 For Decalcification Buffer preparation
Fast Green stain SIGMA Life Sciences F7258 For sample staining
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides Fisher 12-550-15 For sample section collection
HistoPrep Xylene Fisherbrand HC-700-1GAL For sample deparrafinization and staining
Histosette II Tissue Cassettes – Combination Lid and Base Fisher 15-182-701A For sample processing and embedding
HP Z440 Workstation HP Product number: Y5C77US#ABA For histomorphometric analysis and imaging
Manual Rotary Microtome Leica RM 2235 For sample sectioning
Marking pens Leica 3801880 For sample labeling, cassettes and slides
OLYMPUS BX53 Microscope OLYMPUS https://www.olympus-lifescience.com/en/microscopes/upright/bx53f2/ For histomorphometric analysis and imaging
OLYMPUS DP 73 Microscope Camera OLYMPUS https://www.olympus-lifescience.com/en/camera/color/dp73/ For histomorphometric analysis and imaging (discontinued)
ORION STAR A211 pH meter Thermo Scientific STARA2110 For Decalcification Buffer preparation
OsteoMeasure Software OsteoMetrics https://www.osteometrics.com/index.htm For histomorphometric measurement and analysis
Perfusion Two Automated Pressure Perfusion system Leica Model # 39471005 For mouse knee harvest
PRISM 7 Software GraphPad Institutional Access Account Statistical Analysis
Safranin-O stain SIGMA Life Sciences S8884 For sample staining
ThinkBoneStage – Rotating Microscope Stage Think Bone Consulting Inc. – OsteoMetrics (supplier) http://thinkboneconsulting.com/index_files/Slideholder.php For histomorphometric analysis and imaging
Wacom Pro Pen Stylus Wacom https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch For histomorphometric analysis and imaging
Weigerts Iron Hematoxylin A Fisher 5029713 For hematoxylin staining
Weigerts Iron Hematoxylin B Fisher 5029714 For hematoxylin staining
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ma, V. Y., Chan, L., Carruthers, K. J. Incidence, prevalence, costs, and impact on disability of common conditions requiring rehabilitation in the United States: stroke, spinal cord injury, traumatic brain injury, multiple sclerosis, osteoarthritis, rheumatoid arthritis, limb loss, and back pain. Archives of Physical Medicine and Rehabililation. 95 (5), 986-995 (2014).
  2. Hopman, W., et al. Associations between chronic disease, age and physical and mental health status. Journal of Chronic Diseases in Canada. 29 (3), 108-116 (2009).
  3. Lorenz, J., Grässel, S., Singh, S., Coppola, V. Experimental osteoarthritis models in mice. Mouse Genetics. Methods in Molecular Biology. 1194, 401-419 (2004).
  4. Sophia Fox, A. J., Bedi, A., Rodeo, S. A. The basic science of articular cartilage: structure, composition, and function. Journal of Sports Health. 1 (6), 461-468 (2009).
  5. Van der Kraan, P., Van den Berg, W. Chondrocyte hypertrophy and osteoarthritis: role in initiation and progression of cartilage degeneration. Osteoarthritis and Cartilage. 20 (3), 223-232 (2012).
  6. Hodsman, A. B., et al. Parathyroid hormone and teriparatide for the treatment of osteoporosis: a review of the evidence and suggested guidelines for its use. Endocrine Reviews. 26 (5), 688-703 (2005).
  7. Pitsillides, A. A., Beier, F. Cartilage biology in osteoarthritis-lessons from developmental biology. Nature Reviews Rheumatology. 7 (11), 654 (2011).
  8. Yuan, X., et al. Bone-cartilage interface crosstalk in osteoarthritis: potential pathways and future therapeutic strategies. Osteoarthritis and Cartilage. 22 (8), 1077-1089 (2014).
  9. Goldring, S. R., Goldring, M. B. Changes in the osteochondral unit during osteoarthritis: structure, function and cartilage-bone crosstalk. Nature Reviews Rheumatology. 12 (11), 632 (2016).
  10. Martel-Pelletier, J., et al. Osteoarthritis. Nature Reviews Disease Primers. 2 (1), 16072 (2016).
  11. Goldring, M. B., Otero, M. Inflammation in osteoarthritis. Current Opinion in Rheumatology. 23 (5), 471 (2011).
  12. Sellam, J., Berenbaum, F. The role of synovitis in pathophysiology and clinical symptoms of osteoarthritis. Nature Reviews Rheumatology. 6 (11), 625 (2010).
  13. Ma, H., et al. Osteoarthritis severity is sex dependent in a surgical mouse model. Osteoarthritis and Cartilage. 15 (6), 695-700 (2007).
  14. Katon, W., Lin, E. H., Kroenke, K. The association of depression and anxiety with medical symptom burden in patients with chronic medical illness. General Hospital Psychiatry. 29 (2), 147-155 (2007).
  15. Glasson, S., Chambers, M., Van Den Berg, W., Little, C. The OARSI histopathology initiative-recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the mouse. Osteoarthritis and Cartilage. 18, 17-23 (2010).
  16. Pastoureau, P., Leduc, S., Chomel, A., De Ceuninck, F. Quantitative assessment of articular cartilage and subchondral bone histology in the meniscectomized guinea pig model of osteoarthritis. Osteoarthritis and Cartilage. 11 (6), 412-423 (2003).
  17. O’Driscoll, S. W., Marx, R. G., Fitzsimmons, J. S., Beaton, D. E. Method for automated cartilage histomorphometry. Tissue Engineering. 5 (1), 13-23 (1999).
  18. Matsui, H., Shimizu, M., Tsuji, H. Cartilage and subchondral bone interaction in osteoarthrosis of human knee joint: a histological and histomorphometric study. Microscopy Research Technique. 37 (4), 333-342 (1997).
  19. Hacker, S. A., Healey, R. M., Yoshioka, M., Coutts, R. D. A methodology for the quantitative assessment of articular cartilage histomorphometry. Osteoarthritis and Cartilage. 5 (5), 343-355 (1997).
  20. Pastoureau, P., Chomel, A., DeCeuninck, F., Sabatini, M., Pastoureau, P. Methods for Cartilage and Subchondral Bone Histomorphometry. Cartilage and Osteoarthritis. Methods in Molecular Medicine. 101, 79-91 (2004).
  21. McNulty, M. A., et al. A comprehensive histological assessment of osteoarthritis lesions in mice. Cartilage. 2 (4), 354-363 (2011).
  22. Glasson, S., Blanchet, T., Morris, E. The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse. Osteoarthritis and Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).
  23. Singh, S. R., Coppola, V. . Mouse Genetics: Methods and Protocols. , (2004).
  24. Fang, H., Beier, F. Mouse models of osteoarthritis: modelling risk factors and assessing outcomes. Nature Reviews Rheumatology. 10 (7), 413 (2014).
  25. Culley, K. L., Westendorf, J., van Wijnen, A., et al. Mouse Models of Osteoarthritis: Surgical Model of Posttraumatic Osteoarthritis Induced by Destabilization of the Medial Meniscus. Osteoporosis and Osteoarthritis. Methods in Molecular Biology. 1226, 143-173 (2015).
  26. Van der Kraan, P. Factors that influence outcome in experimental osteoarthritis. Osteoarthritis and Cartilage. 25 (3), 369-375 (2017).
  27. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
  28. Callis, G., Sterchi, D. Decalcification of bone: literature review and practical study of various decalcifying agents. Methods, and their effects on bone histology. Journal of Histotechnology. 21 (1), 49-58 (1998).
  29. Lajeunesse, D., Massicotte, F., Pelletier, J. P., Martel-Pelletier, J. Subchondral bone sclerosis in osteoarthritis: not just an innocent bystander. Modern Rheumatology. 13 (1), 0007-0014 (2003).
  30. Li, G., et al. Subchondral bone in osteoarthritis: insight into risk factors and microstructural changes. Arthritis Research Therapy. 15 (6), 223 (2013).
  31. Kapoor, M., Martel-Pelletier, J., Lajeunesse, D., Pelletier, J. P., Fahmi, H. Role of proinflammatory cytokines in the pathophysiology of osteoarthritis. Nature Reviews Rheumatology. 7 (1), 33 (2011).
  32. Scanzello, C. R., Goldring, S. R. The role of synovitis in osteoarthritis pathogenesis. Bone. 51 (2), 249-257 (2012).
  33. Benito, M. J., Veale, D. J., FitzGerald, O., van den Berg, W. B., Bresnihan, B. Synovial tissue inflammation in early and late osteoarthritis. Annals of the Rheumatic Diseases. 64 (9), 1263-1267 (2005).
  34. De Lange-Brokaar, B. J., et al. Synovial inflammation, immune cells and their cytokines in osteoarthritis: a review. Osteoarthritis and Cartilage. 20 (12), 1454-1499 (2012).
  35. Findlay, D. M., Kuliwaba, J. S. Bone-cartilage crosstalk: a conversation for understanding osteoarthritis. Bone Research. 4, 16028 (2016).
  36. Lories, R. J., Luyten, F. P. The bone-cartilage unit in osteoarthritis. Nature Reviews Rheumatology. 7 (1), 43 (2011).
  37. Pritzker, K. P., et al. Osteoarthritis cartilage histopathology: grading and staging. Journal of Osteoarthritis and Cartilage. 14 (1), 13-29 (2006).
  38. Hayami, T., et al. Characterization of articular cartilage and subchondral bone changes in the rat anterior cruciate ligament transection and meniscectomized models of osteoarthritis. Bone. 38 (2), 234-243 (2006).
  39. Priemel, M., et al. mineralization defects and vitamin D deficiency: Histomorphometric analysis of iliac crest bone biopsies and circulating 25-hydroxyvitamin D in 675 patients. Journal of Bone and Mineral Research. 25 (2), 305-312 (2010).
  40. Yukata, K., et al. Continuous infusion of PTH 1–34 delayed fracture healing in mice. Scientific Reports. 8 (1), 13175 (2018).
  41. Kawano, T., et al. LIM kinase 1 deficient mice have reduced bone mass. Bone. 52 (1), 70-82 (2013).
  42. Zhang, L., Chang, M., Beck, C. A., Schwarz, E. M., Boyce, B. F. Analysis of new bone, cartilage, and fibrosis tissue in healing murine allografts using whole slide imaging and a new automated histomorphometric algorithm. Bone Research. 4, 15037 (2016).
  43. Wu, Q., et al. Induction of an osteoarthritis-like phenotype and degradation of phosphorylated Smad3 by Smurf2 in transgenic mice. Arthritis Rheumatism. 58 (10), 3132-3144 (2008).
  44. Hordon, L., et al. Trabecular architecture in women and men of similar bone mass with and without vertebral fracture: I. Two-dimensional histology. Bone. 27 (2), 271-276 (2000).

Tags

HistomorphometricOsteoarthritisJoint ChangesQuantitative AnalysisCartilageBoneReproducibleStandardized ProtocolMouse ModelCalcified CartilageChondrocyteSubchondral Bone

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Pinamont, W. J., Yoshioka, N. K., Young, G. M., Karuppagounder, V., Carlson, E. L., Ahmad, A., Elbarbary, R., Kamal, F. Standardized Histomorphometric Evaluation of Osteoarthritis in a Surgical Mouse Model. J. Vis. Exp. (159), e60991, doi:10.3791/60991 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image