Aqui descrevemos métodos usando microscopia de tempo-lapso, contraste de fase para macrófagos peritoneal residentes em camundongos em um gradiente c5a complementar quimático. Os protocolos podem ser estendidos a outras células imunes.
Quimiotáxi é uma orientação mediada por receptores de células ao longo de um gradiente químico, enquanto a quimiocinese é a estimulação da motilidade celular aleatória por um produto químico. Quimiocinese e quimiotáxi são fundamentais para a mobilização e implantação de células imunes. Por exemplo, quimiocinas (citocinas quimiotáticas) podem rapidamente recrutar neutrófilos e monócitos circulantes para locais extravasculares de inflamação. Os receptores quimio-atratores pertencem à grande família de receptores acoplados à proteína G. Como os gradientes quimioatrativos (ou seja, ligantes) migração direta de células através da sinalização receptora acoplada à proteína G ainda não é totalmente compreendida. No campo da imunologia, os neutrófilos são células modelo populares para estudar quimiotáxi in vitro. Aqui descrevemos um ensaio de quimiotaxis bidimensionais em tempo real (2D) adaptado para macrófagos residentes em camundongos, que tradicionalmente têm sido mais difíceis de estudar. Os macrófagos movem-se a um ritmo lento de ~1 μm/min em uma superfície 2D e são menos adequados para ensaios de migração de fonte de ponto (por exemplo, migração para a ponta de uma micropipeta cheia de quimioa) do que neutrófilos ou Dictyostelium discoideum,que movem uma ordem de magnitude mais rapidamente. Ensaios transwell amplamente utilizados são úteis para estudar a atividade quimiotática de diferentes substâncias, mas não fornecem informações sobre morfologia celular, velocidade ou navegação quimiotática. Aqui descrevemos um ensaio de quimiosquim baseado em microscopia baseada em microscopia de lapso de tempo que permite quantificação da velocidade celular e eficiência quimiotática e fornece uma plataforma para delinear os transdutores, caminhos de sinal e efeitos de quimiotáxis.
As células imunes normalmente migram singly em uma superfície 2D de forma ameboida1,2, que envolve ciclos repetidos de saliência da frente, adesão celular mediada por integrino e retração da parte traseira. Um passo pré-requisito é a polarização celular, na qual as células formam extremidades dianteiras e traseiras3. A quimiotaxis começa com a detecção de quimioatraçãopor receptores acoplados à proteína G e uma rede de sinalização complexa mediada por proteínas G heterocutéricas ancoradas por membranae pequenas proteínas G monóricas, bem como fatores de troca de nucleotídeos de guanina ligados à fosfolipípóide (GEFs)4,5. Ativação de Rho GTPases das subfamílias Cdc42 e Rac induzem saliências na frente6 e membros da subfamília Rho, especialmente RhoA, ativam a contração da traseira5,7. Em um ambiente tridimensional (3D), os integrinos são em grande parte redundantes para a migração de leucócitos e a RhoA torna-se mais importante para espremer células através de passagens estreitas8, enquanto a ativação arp2/3 induzida por Cingimento ou Rac permanece importante para a direção quimiotática9,10.
As células imunes podem enfrentar diferentes quimioatrativos, especialmente nos cenários de lesões teciduais, invasão de patógenos e inflamação. Os quimioatrativos endógenos expressos em farócitos complementam C3a e C5a, são rapidamente gerados pela ativação da cascata complementar, e são reconhecidos pelos receptores Complementar C3a e C5a. Da mesma forma, as células necróticas recrutam fagócitos através de receptores de peptídeos formyl, que reconhecem mitocôndrias derivadas, bem como peptídeos formirl derivados de bactérias11. As células imunes também expressam receptores acoplados à proteína G para quimiocinas, uma grande família de peptídeos quimioatrativos envolvidos na regulação do tráfico de células imunes durante a homeostase e inflamação. As quimiocinas são classificadas em quatro grupos, dependendo do espaçamento dos dois primeiros resíduos de cisteína (C): C, CC, CXC e CX3C citocinas, onde X é um aminoácido. Assim, as células imunes in vivo precisam responder adequadamente a sinais espaciais e temporais altamente complexos, tornando o estudo da quimiotaxis uma tarefa assustadora. Abaixo, fornecemos um breve histórico de quimiotáxis, que começou com abordagens de imagem intravital.
O estudo da quimiocida quimiotaxis data de 188812, quando o oftalmologista Theodor Karl Gustav Leber descreveu claramente a migração dirigida de leucócitos para, e o acúmulo em, locais de inflamação em um modelo de ceratite micótica (fúngica). Leber ressaltou que a atração de leucócitos em excesso por substâncias derivadas de patógenos é importante para a eliminação de microrganismos nocivos via fagocitose, que havia sido descrita por Metchnikoff (também conhecido como Metschnikoff) no início da mesma década13. Experimentos in vivo também foram realizados na década de 1920 por Clark e Clark14,15, que se aproveitaram da transparência dos girinos e mostraram que a inflamação estéril induzida pelo óleo de croton14 ou outros irritantes15 fez com que os leucócitos aderissem aos vasos sanguíneos, seguidos de diapedese (migração transendothelial) e migração rápida através dos espaços teciduais em direção ao irritante. Experimentos in vitro utilizando o método de microcinematografia desenvolvido por Jean Comandon16 mostraram que os leucócitos migraram para uma fonte quimiosódica particulada, como a bactéria17. Naquela época, as identidades moleculares dos fatores quimiotáticos eram desconhecidas. Na década de 1960, Stephen Boyden18 reconheceu que faltavam técnicas para estudar a atividade quimiotática de substâncias solúveis. Ele criou uma câmara, posteriormente conhecida como câmara de Boyden, com dois compartimentos separados por uma membrana de papel filtro. Uma suspensão celular é adicionada ao compartimento superior e a substância de ensaio é adicionada aos dois compartimentos ou apenas ao compartimento inferior. Após um período de incubação, a membrana do filtro é removida, e as células são fixas e manchadas. Comparando quantas células migram através da membrana do filtro em direção ao poço inferior com a substância de ensaio em ambos os compartimentos, em nenhum dos compartimentos, ou apenas no compartimento inferior, a atividade quimiotática pode ser determinada. Os ensaios transwell ainda são populares hoje em dia e foram modificados de várias formas, incluindo o uso de diferentes membranas de policarbonato com tamanhos e densidades poros definidos19,20. Uma grande desvantagem dos ensaios da Transwell é que é impraticável visualizar diretamente as células migrando e o caminho de migração através da membrana normalmente não excede o diâmetro de uma célula imune.
Sally H. Zigmond desenvolveu uma câmara de quimiotáxi21 que permitiu a visualização tanto da formação gradiente quanto da morfologia celular usando corantes fluorescentes. A câmara consiste em um deslizamento de plexiglass (acrílico) com dois poços lineares paralelos, cada um com um volume de ~100 μL, separadopor uma ponte de 1 mm de largura 3-10 μm abaixo do plano superior do slide. Um deslizamento de cobertura semeado com células é invertido e colocado sobre o escorregador de tal forma que abrange os dois poços. Após a adição de um quimioatrativo a um dos poços, um gradiente quimioatrativo íngreme se forma através da ponte, tipicamente dentro de 30-90 min. Leucócitos polimorfonuclears humanos (granulocitos) na câmara de Zigmond são observados orientando-se para o chemoattractant. Variações da câmara de Zigmond foram relatadas, incluindo as 23 câmaras Dunn22 e Insall23, ambas usando um deslizamento de cobertura semeado com células colocadas em dois poços separados por uma ponte de 1 mm de largura. A câmara de Dunn consiste em poços concêntricos separados por uma ponte circular, enquanto a câmara Insall está mais intimamente relacionada com a câmara de Zigmond, mas fornece pontes de duas larguras diferentes, 0,5 mm e 1 mm. Uma nova câmara de quimiotáxi, denominada μ-Slide Chemotaxis e fabricada por moldagem por injeção plástica, foi descrita por Zemgel et al.24. A câmara de quimiotáxi consiste em dois reservatórios de 40 μL separados por um canal de 1 mm de largura com comprimento de 2 mm e altura de 70 μm. A parte inferior da câmara é formada por uma folha de plástico permeável a gás com a mesma espessura e propriedades ópticas de um deslizamento de cobertura de vidro nº 1.524. Aqui descrevemos um ensaio de quimiotáxi usando a câmara μ-Slide Chemotaxis para visualizar a migração de macrófagos peritoneal residentes em camundongos por até 14 h em um gradiente quimiotático (complemento C5a).
A imagem intravital remonta ao século XIX e fornece um meio de estudar o comportamento das células imunes vivas em seu ambiente natural. No entanto, mesmo com a microscopia avançada de hoje e técnicas genéticas é difícil estudar a resposta das células a quimioatraçãodores específicos in vivo. Para contornar esse problema, Boyden18 desenvolveu ensaios transwell na década de 1960, mas esses ensaios de ponto final não forneceram visualização de como as células realmente migraram para a quimioatração, dificultando a distinção da quimiocinese, estimulando a migração aleatória por uma sugestão química32, e quimiotáxis, migração para maiores concentrações de estímulos químicos uns dos outros33. Esse problema foi resolvido com o desenho de várias câmaras abertas com uma ponte, tipicamente de 1 mm de largura, situada entre dois reservatórios e acessível por uma lente objetiva21,22,23. Aplicando um deslizamento de cobertura invertido, semeado com células aderentes, fecha as câmaras e o quimioaa atraiudor adicionado a um dos reservatórios difusos através da ponte para o reservatório oposto, criando um gradiente de concentração. Aqui descrevemos um ensaio de quimiotáxi usando o mesmo princípio, mas usando uma câmara fechada com quatro portas de enchimento. Utilizando este sistema e microscopia de contraste de fase, desenvolvemos um ensaio para macrófagos peritoneal residentes em camundongos que migram em um complemento quimiotático C5a gradiente31,,34,35,36. Este ensaio, combinado com modelos de camundongos knockout, mostrou-se fundamental na investigação dos papéis de vários Rho GTPases e proteínas motoras em morfologia, motilidade e quimiotáxi31,34,35,36,37. Também usamos essa abordagem para imagem de monócitos de sangue periféricos humanos migrando em uma superfície 2D ou em uma matriz de colágeno 3D tipo I38. Além disso, o ensaio é adequado para macrófagos ou macrófagos derivados da medula óssea do rato derivados de células precursoras de mieloide sinuosas39,40. Já usamos sacos de politetrafluoroetileno (PTFE) com adaptadores luer para cultivar células de medula óssea e obter macrófagos34. A vantagem dos sacos PTFE é que as células podem ser prontamente suspensas e prontas para uso depois de colocar o saco no gelo por 20-30 min. Note que pré-preenchemos a área de observação do slide de quimiotaxis antes de introduzir as células. Esta abordagem tem a vantagem de que bolhas de ar indesejadas podem ser posteriormente lavadas (com sucesso variável) e a área de observação presaaked permite a introdução lenta de uma suspensão celular por pipetting. O pré-enchimento, porém, aumenta a probabilidade de que o meio flua parcialmente em um ou ambos os reservatórios de flanqueamento, o que promoverá a semeação de células além da área de observação. Alternativamente, a suspensão celular pode ser diretamente encanada em uma área de observação seca, mas bolhas de ar indesejadas não podem ser posteriormente expelidas.
A cavidade peritoneal do camundongo contém duas populações principais de células: F4/80+ macrófagos e (menores) CD19+ Células B, numa razão de cerca de 1:2(Figura 4A). Essas duas populações celulares representam mais de 95% das células da cavidade peritoneal, enquanto as células F4/80–/CD19restantes geralmente podem ser identificadas como CD11c+ células (células dendríticas) ou CD3+ células (células T). As células B fracamente aderentes são lavadas da área de observação durante o enchimento dos reservatórios com o meio (Figura 2). Depois de adicionar quimioaqueem a um dos dois reservatórios, a microscopia de contraste de tempo pode ser usada para visualizar as células remanescentes (macrófagos) migrando em um gradiente quimioatrativo em evolução. A formação do gradiente complementar C5a na área de observação, através da difusão de um reservatório para o outro, pode ser simulada utilizando um corante fluorescente com peso molecular semelhante. Um bom substituto para o complemento do rato recombinante C5a (peso molecular previsto, 9,0 kDa) é fluorescentemente rotulado dextran (10 kDa)31. Utilizando-se microscopia confocal, o gradiente de fluorescência no canal estreito (área de observação) que conecta os dois reservatórios do escorregador de quimiotáxi pode ser medido em intervalos fixos e os perfis de concentração nos diferentes pontos de tempo podem ser plotados24,31. Rotineiramente adicionamos um corante azul não fluorescente (Patent Blue V) ao meio quimioatrativo para fornecer um indicador visual conveniente de difusão e formação gradiente. Dentro de 1h da introdução de 15 μL de meio azul, contendo quimiotratores em um reservatório, o reservatório parece uniformemente azul e, de acordo com as leis de difusão de Fick, um gradiente se formará através da estreita área de observação que liga os reservatórios(Figura 3B). Vários dias são necessários para que o soluto (corante azul ou quimioa) se torne uniformemente distribuído.
A microscopia de fluorescência pode ser substituída por microscopia de contraste de fase, que oferece vantagens para o rastreamento automatizado de células, pois células rotuladas fluorescentes podem ser facilmente distinguidas do fundo. Outra vantagem é que populações específicas de células imunes podem ser seletivamente rastreadas após rotular marcadores de superfície com anticorpos fluorescentes. Utilizou-se essa abordagem para imagem de sangue periférico humano CD14+ células (monócitos) migrando em um gradiente quimiotático fMLP (N-formylmethionine-leucyl-fenil-fenilanina)gradiente 38. Da mesma forma, anticorpos anti-F4/80 fluorescentes poderiam ser usados para imagem de macrófagos de camundongos migrando em um gradiente c5a complemento quimiotático. Fototoxicidade é uma desvantagem potencial do uso de imagens de fluorescência41. Isso pode ser reduzido por vários meios42, incluindo o uso de fluoróforos excitados com comprimentos de onda mais longos e a dição de antioxidantes ao meio. Alternativamente, as células rotuladas poderiam inicialmente ser identificadas por microscopia de fluorescência e posteriormente imagens por microscopia de tempo-lapso, contraste de fase. No entanto, na prática, as células que se movem a velocidades moderadamente baixas, como ~1 μm/min (macrófagos) ou ~4 μm/min (monócitos), podem ser imagens intermitentes por microscopia de fluorescência em intervalos de minutos, o que é bem tolerado38. Anteriormente, utilizou-se a microscopia de fluorescência e o slide de quimiotáxi descrito aqui para ensaios quimiotaxis 3D38,43. Neste caso, ambos os reservatórios foram pré-preenchidos com meio médio e 15 μL de quimio-contendo quimioadores foi arrastado para um dos reservatórios imediatamente antes de lentamente pipetar células fluorescentes rotuladas de fluorescente suspensas em meio contendo colágeno tipo I para a área de observação. A parte difícil deste procedimento é o manuseio do colágeno tipo I, que está concentrado em solução ácida. O pH da solução de colágeno precisa ser neutralizado pela adição de solução alcalina antes de misturar a solução de colágeno gelado com a suspensão celular. A transferência da mistura de colágeno-célula para uma incubadora a 37 °C iniciará a polimerização do colágeno. Durante a incubação, o slide deve ser lentamente girado em torno de seu eixo longo para que as células permaneçam distribuídas uniformemente nas direções do eixo X, Y e Z enquanto o colágeno polimeriza em um gel. Um slide de quimiotáxi fechado relacionado adequado para ensaios de quimiotáxi 3D, com seis plugues em vez de quatro plugues, foi recentemente descrito29. Este sistema permite que a mistura de colágeno-célula seja introduzida na área de observação antes de encher independentemente cada um dos reservatórios de flanqueamento, porque cada reservatório tem duas portas de enchimento, em vez de uma única porta.
Em resumo, descrevemos um ensaio quimiotaxis em tempo real que permite a visualização de células navegando em um gradiente quimiotático durante um período de 6 ou mais horas. Aqui nos concentramos em macrófagos, que desempenham papéis importantes em doenças inflamatórias, mas têm sido sub-representados em ensaios quimiotáxiem-se em tempo real em comparação com células móveis mais rápidas como neutrófilos e ameba de Dictyostelium.
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi apoiado por uma subvenção (HA 3271/3-2) do DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft).
µ-Slide (anodized aluminium) rack | Ibidi, Martinsried, Germany | 80003 | Autoclavable stackable rack for channel slides |
µ-Slide Chemotaxis 2D (chemotaxis slide) | Ibidi, Martinsried, Germany | 80306 | Slide containing chemotaxis chambers (tissue culture treated) |
100x penicillin/streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Used as supplement for RPMI 1640 media |
10-100 µL pipette with volume control ring | Eppendorf | 3123000047 | Eppendorf Research plus pipette |
10-200 µL pipette tips | Greiner Bio-One International | 739261 | Pipette tips with beveled tips (96 pieces per rack: sterile) |
14 ml polypropylene round bottom tubes | BD Falcon | 352059 | Used to collect peritoneal cells |
14-bit Hamamatsu C9100-50 Electron Multiplying-Charged Couple Device (EM-CCD) peltier-cooled camera | Hamamatsu Photonics Inc., Japan | EM-CCD camera of the spinning disk confocal microscope system | |
2-20 µL pipette with volume control ring | Eppendorf | 3123000039 | Eppendorf Research plus pipette |
24-G plastic catheter | B Braun Mesungen AG, Germany | 4254503-01 | Used for peritoneal lavage |
405 nm solid state laser, 50 mW | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | Laser (405 nm) source of spinning disk confocal microscope system | |
488 nm solid state laser, 50 mW | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | Laser (488 nm) source of spinning disk confocal microscope system | |
561 nm solid state laser, 50 mW | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | Laser (561 nm) source of spinning disk confocal microscope system | |
Alexa Fluor 488-conjugated rat (IgG2a) monoclonal (clone BM8) anti-mouse F4/80 antibody | Thermo Fisher Scientific | MF48020 | Mouse macrophage marker and plasma membrane label |
Alexa Fluor 594-conjugated rat (IgG2a) monoclonal (clone 6D5) anti-mouse CD19 antibody | BioLegend | 115552 | Mouse B cell marker |
C-Chip disposable (improved Neubauer) hemocytometer | NanoEnTek (distributed by VWR International) | 631-1098 | Used to count cells |
CSU-X1 spinning disk scanner | Yokogawa Electric Corporation, Japan | Nipkow spinning disk unit | |
Hank’s buffered salt solution without Ca2+ and Mg2+ | Thermo Fisher Scientific | 14170120 | Used for peritoneal lavage |
Heat-inactivated fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 10082139 | Used as supplement for RPMI 1640 media |
Hoechst 34580 | Thermo Fisher Scientific | H21486 | Cell permeable, blue fluorescent nucleic acid stain |
ImageJ (image processing and analysis in Java) | National Institutes of Health (NIH) | Image analysis software | |
Lipopolysaccharides from Escherichia coliO111:B4 | Sigma-Aldrich | L4391-1MG | Toll-like receptor 4 ligand |
Nikon Eclipse Ti inverse microscope | Nikon, Japan | Inverted microscope | |
Patent Blue V, sodium salt | Sigma-Aldrich | 21605-10G | Blue-colored dye used as visual indicator of gradient formation |
Recombinant mouse complement C5a protein | R&D Systems | 2150-C5-025 | Chemoattractant for mouse macrophages |
RPMI 1640 medium containing 20 mM Hepes | Sigma-Aldrich | R7388 | Basis medium for assays |
UltraVIEW Vox 3D live cell imaging system + Volocity software | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | Spinning disk confocal microscope system | |
Zeiss LSM 510 + Axiovision software | Carl Zeiss Microscopy, Oberkochen, Germany | Confocal laser scanning microscope (LSM) adapted for phase-contrast microscopy |