여기에서 우리는 화학 전술 보완 C5a 구배를 이미지 마우스 상주 복막 대식세포에 시간 경과, 위상 대조 현미경 검사법을 사용하여 방법을 설명합니다. 프로토콜은 그밖 면역 세포로 확장될 수 있습니다.
화학변균은 화학적 구배를 따라 세포의 수용체 매개 지도인 반면, 케모키네스는 화학물질에 의한 무작위 세포 운동성의 자극이다. 케모키네스와 화학변균은 면역 세포의 동원 과 배치에 대한 기본입니다. 예를 들어, 화학요법 (화학 적 사이토 카인)은 염증의 외혈관 부위에 순환 호중구와 단핵구를 빠르게 모집 할 수 있습니다. 화학 유력 제 수용 체 G 단백질 결합 된 수용 체의 큰 가족에 속한다. 화학적 유저제(즉, 리간드) 그라데이션이 G 단백질 결합 수용체 신호화를 통한 직접 세포 이동은 아직 완전히 이해되지 않는다. 면역학 분야에서 호중구는 시험관 내 화학 택시를 연구하기위한 인기있는 모델 세포입니다. 여기에서 우리는 마우스 상주 대식세포에 맞춘 실시간 2차원 (2D) 화학변세포 분석법을 기술합니다, 이는 전통적으로 공부하기 더 어려웠습니다. 대식세포는 2D 표면에서 ~1 μm/min의 느린 속도로 이동하고 호중구 또는 Dictyostelium discoideum보다포인트 소스 이동 분석 (예를 들어, 화학 유저제로 채워진 마이크로 파이펫의 끝으로 이동)에 덜 적합합니다. 널리 사용되는 Transwell 어소시에이션은 다른 물질의 화학 활성을 연구하는 데 유용하지만 세포 형태, 속도 또는 화학 적 탐색에 대한 정보를 제공하지 않습니다. 여기에서 우리는 세포 속도 및 화학 적 효율성의 정량화를 허용하고 트랜스듀서, 신호 경로 및 화학 요법의 이펙터를 묘사하는 플랫폼을 제공하는 시간 경과 현미경 검사법 기반 대식세포 화학 요법 을 설명합니다.
면역 세포는 전형적으로 아메바디드방식으로2D 표면상에서 개별적으로 이동하며, 이는 전방의 돌출, 인테그린 매개 세포 부착 및 후방의 후퇴를 반복하는 주기를 수반한다.,2 전제 조건 단계는 세포가 전면및 후면 끝3을형성하는 세포 편광입니다. 화학변색은 G 단백질 결합 수용체에 의한 화학유약체 검출과 막 고정된 이종성 G 단백질및 작은 단조체 G 단백질뿐만 아니라 인지질 결합 구아닌 뉴클레오티드 교환 인자(GEFs)4,,5에의해 매개되는 복잡한 신호 네트워크로 시작된다. Cdc42 및 Rac 하위 패밀리의 로 GTPases의 활성화는 전방6및 로 소가족, 특히 RhoA의 구성원에서 돌출을 유도하고,후방5,7의수축을 활성화한다. 3차원(3D) 환경에서, 인테그린은 백혈구 이동을 위해 대체로 중복되고 RhoA는 좁은 통로8을통해 세포를 압박하는 데 더 중요해지는 반면, Cdc42- 또는 Rac-유도9Arp2/3 활성화는 화학조향9,,10에대해 여전히 중요하다.
면역 세포는 다른 화학 물질에 직면할 수 있습니다., 특히 조직 손상의 설정에서, 병원 체 침략, 그리고 염증. 식세포에 발현된 내인성 화학유채는 C3a 및 C5a를 보완하고, 보체 캐스케이드의 활성화에 의해 빠르게 생성되고, C3a 및 C5a 수용체를 보완함으로써 인식된다. 유사하게, 괴사 세포는 미토콘드리아 유래뿐만 아니라 박테리아 유래 포르밀펩티드(11)를인식하는 포밀 펩티드 수용체를 통해 식세포를 모집한다. 면역 세포는 또한 화학에 대 한 G 단백질 결합 된 수용 체를 표현, 항상성 및 염증 동안 면역 세포 인신 매매의 조절에 관여 하는 화학 유력 펩 티 드의 큰 가족. 케모카인은 처음 두 개의 시스테인 (C) 잔기의 간격에 따라 4 개의 그룹으로 분류 됩니다: C, CC, CXC, 그리고 CX3C 사이토 카인, 어디 X는 아미노산. 따라서 생체 내 면역 세포는 매우 복잡한 공간 및 시간적 신호에 적절하게 반응하여 화학 요법연구를 어려운 과제로 삼을 필요가 있습니다. 아래에서 우리는 intravital 화상 진찰 접근으로 시작된 화학요법의 간략한 역사를 제공합니다.
백혈구 화학 요법의 연구는 1888년 12년으로 거슬러 올라갑니다. Leber는 병원균 유래 물질에 의한 과잉 백혈구의 매력이 같은 10 년10년 초에 Metchnikoff (Metschnikoff라고도 함)에 의해 설명 된 식세포증을 통해 유해한 미생물을 제거하는 데 중요하다고 강조했습니다. 생체 내 실험은 또한 클라크와 클라크 에 의해 1920 년대에 수행되었다14,,15,누가 올챙이의 투명성을 활용하고 크로톤 오일에 의해 유도 된 멸균 염증을 보여 주었다14 또는 다른 자극제15 혈관에 부착 백혈구 발생, 투이페데시스 에 의해 다음 (transendothelialalilial) 및 조직 공간을 통해 급속한 이동. Jean Comandon16에 의해 개발된 마이크로시네마토그래피 방법을 이용한 시험관내 실험은 백혈구가 박테리아17과같은 미립자 화학유저물 공급원으로 이동하는 것을 보여주었다. 그 당시, 화학 전술 요인의 분자 정체성은 알려지지 않았습니다. 1960 년대에, 스티븐 보이든18 수용 성 물질의 화학 활성을 연구 하는 기술이 부족 했다 인식. 그는 이후 보이든 챔버로 알려진 챔버를 고안했으며, 두 개의 구획이 필터 종이 멤브레인으로 분리되었습니다. 세포 현탁액은 상부 구획에 추가되고 시험 물질은 두 구획 또는 하부 구획에만 추가됩니다. 잠복기 후, 필터 멤브레인이 제거되고 세포가 고정되고 염색됩니다. 필터 막을 가로질러 이동하는 세포 의 수를 두 구획의 시험 물질과 함께 하부 웰쪽으로 이동시키는 방법을 비교함으로써, 구획에서, 또는 하부 구획에서만, 화학 전술 활성을 결정할 수 있습니다. Transwell 어소시에이스는 오늘날에도 여전히 인기가 있으며 정의된 기공 크기와 밀도가 다른 폴리 카보네이트 멤브레인의 사용을 포함하여 다양한 방법으로 변형되어19,,20. Transwell 통종의 주요 단점은 직접 세포 마이그레이션 및 막을 가로 질러 이동 경로 면역 세포의 직경을 초과 하지 않는 시각화 하는 비실용적이 다.
샐리 H. 지그몬드는 형광 염료를 사용하여 그라데이션 형성과 세포 형태 모두를 시각화 할 수있는 화학 요법 챔버21을 개발했습니다. 챔버는 두 개의 평행 선형 웰이있는 플렉시 유리 (아크릴) 슬라이드로 구성되며, 각각 ~ 100 μL의 부피를 가지며 슬라이드의 상부 평면 아래 1mm 폭 의 다리 3-10 μm으로 구분됩니다. 세포로 시드 된 커버 슬립은 반전되어 두 개의 우물에 걸쳐 있도록 슬라이드에 놓습니다. 우물 중 하나에 화학 흡입제를 첨가 한 후, 다리를 가로 지르는 가파른 화학 적 구배 형태는 일반적으로 30-90 분 이내에 지그몬드 챔버의 인간 다형성 핵 백혈구 (과립구)가 화학 흡입제를 향하도록 관찰됩니다. 지그몬드 챔버의 변형은 던(22)과 Insall23 챔버를 포함하여 보고되었으며, 둘 다 1mm 폭의 다리로 분리 된 두 개의 우물에 배치 된 세포로 시드 된 커버 슬립을 사용합니다. 던 챔버는 원형 브리지로 분리 된 동심 우물로 구성되어 있으며 Insall 챔버는 지그몬드 챔버와 더 밀접하게 관련되어 있지만 0.5 mm및 1mm의 두 개의 서로 다른 폭의 다리를 제공합니다. 새로운 화학 변균 챔버, μ-Slide 화학 요법이라고하고 플라스틱 사출 성형에 의해 제조, Zemgel 등24에의해 설명되었다. 화학 전염 챔버는 길이 2mm와 높이 70 μm의 1mm 폭 채널로 분리 된 두 개의 40 μL 저수지로 구성됩니다. 챔버의 바닥은 No. 1.5 유리 커버 슬립(24)의두께 및 광학 적 특성과 동일한 가스 투과성, 얇은 플라스틱 시트에 의해 형성된다. 여기서 우리는 μ-Slide 화학요법 챔버를 사용하여 화학전술(complement C5a) 구배에서 최대 14시간 동안 마우스 상주 복막 대식세포의 이동을 시각화하는 화학동선증 을 기술한다.
Intravital 화상 진찰은 19 세기로 거슬러 올라가고 그들의 자연 환경에서 살아있는 면역 세포의 행동을 공부하는 수단을 제공합니다. 그러나, 오늘날의 고급 현미경 검사법 및 유전 기술로도 생체 내에서 특정 화학 물질에 대한 세포의 반응을 연구하기가 어렵습니다. 이 문제를 회피하기 위하여는, Boyden18는 1960년대에 Transwell 어셀을 개발했습니다, 그러나 이 종점 측정은 세포가 실제로 화학유역으로 이동하는 방법의 시각화를 제공하지 않았습니다, 화학 큐에 의하여 무작위로 이동을 자극하는 chemokinesis를 구별하는 것을 어렵게 하고, 화학 큐32에의하여 무작위 이동을 자극하고, 화학적 자극의 높은 농도를 향해33. 이러한 문제점은 교량이 있는 다양한 개방 챔버를 설계함으로써 해결되었으며, 전형적으로 1 mm 폭, 두 개의 저수지 사이에 위치하고 대물렌즈(21,,22,23)에23의해 접근가능하여 해결되었다. 거꾸로 커버 슬립을 적용, 부착 세포와 시드, 챔버를 닫고 화학 력은 반대 저수지에 다리를 가로 질러 확산 저수지 중 하나에 추가, 농도 구배를 생성. 여기에서 우리는 동일한 원리를 사용하여 그러나 4개의 충전 포트를 특징으로 하는 닫힌 챔버를 사용하여 화학선염 분석법을 기술합니다. 이 시스템과 시간 경과, 위상 대비 현미경 을 사용하여, 우리는 화학 적 보완 C5a 그라데이션31,,34,,35,,36에서이동 하는 마우스 상주 복막 대식 세포에 대한 분석법을 개발했다. 이 분석법은 녹아웃 마우스 모델과 결합되어 대식세포 형태, 운동성 및 화학요법31,,34,,,35,36,,37에서다양한 Rho GTPases 및 운동 단백질의 역할을 조사하는 데 중요한 역할을 입증했다. 우리는 또한 2D 표면 또는 3D 콜라겐 유형 I 매트릭스38에서이동하는 인간 말초 혈액 단핵구를 이미지화하기 위해 이 접근법을 사용하였다. 더욱이, 상기 분석은 조건부 불멸의 골수성 전구세포39,,40으로부터유래된 마우스 골수 유래 대식세포 또는 대식세포에 적합하다. 우리는 이전에 배양 골수 세포에 루어 어댑터와 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 (PTFE) 가방을 사용하고 대식세포를 얻을34. PTFE 백의 장점은 세포를 쉽게 다시 중단하고 20-30 분 동안 얼음에 가방을 놓은 후 사용할 준비가 될 수 있다는 것입니다. 이러한 접근법은 원치 않는 기포가 이후에 플러시될 수 있다는 장점이 있으며(가변적 성공) 미리 흡수된 관측 영역은 파이펫팅에 의한 셀 현탁액의 느린 도입을 가능하게 한다. 그러나 프리필링은 매질이 측면 저장소 중 하나 또는 둘 다로 부분적으로 흐를 가능성을 증가시켜 관찰 영역을 넘어 세포의 시드를 촉진합니다. 또는, 셀 현탁액은 건조한 관측 영역으로 직접 파이펫을 할 수 있지만 원치 않는 기포는 이후에 추방될 수 없습니다.
마우스의 복막 구멍은 세포의 두 가지 주요 집단을 포함: F4/80+ 대식 세포 및 (작은) CD19+ B 세포, 약의 비율로 1:2(그림 4A). 이 2개의 세포 인구는 복강 세포의 95% 이상을 차지하는 반면, 나머지 F4/80–/CD19-세포는 일반적으로 CD11c+ 세포 (수지상 세포) 또는 CD3+ 세포 (T 세포)로 식별 될 수 있습니다. 약하게 부착된 B 세포는 배지로 저장소를 채우는 동안 관찰 영역 밖으로 세척된다(도2). 두 개의 저수지 중 하나에 화학 유저를 추가 한 후, 시간 경과, 위상 대비 현미경 검사법은 진화하는 화학 력 그라데이션에서 이동하는 나머지 세포 (대식세포)를 이미지화하는 데 사용할 수 있습니다. 한 저수지에서 다른 저수지로의 확산을 통해 관찰 영역에서 보완C5a 구배의 형성은 유사한 분자량을 가진 형광 염료를 사용하여 시뮬레이션할 수 있다. 재조합 마우스 보체 C5a(예측 분자량, 9.0 kDa)에 대한 좋은 대용품은 형광으로 표지된 덱젠(10 kDa)31이다. 공초점 현미경을 이용하여, 화학탁증 슬라이드의 두 개의 저장소를 연결하는 좁은 채널(observation area)에서형광 구배가 서로 다른 시점에서 고정 된 간격및 농도 프로파일로 측정될 수있다(24,,31). 우리는 정기적으로 비형광, 청색 염료 (특허 블루 V)를 화학 적 인 배지에 추가하여 확산 및 그라데이션 형성의 편리한 시각적 지표를 제공합니다. 15 μL의 청색, 화학유채 함유 배지를 저수지에 도입한 후 1시간 이내에, 저수지는 균일하게 파란색으로 나타나고, Fick의 확산 법칙에 따라, 그라데이션은 저수지를 연결하는 좁은 관측 구역을 가로질러 형성될것이다(그림 3B). 용질 (청색 염료 또는 화학 적)이 균일하게 분포되기 위해서는 며칠이 필요합니다.
형광 검사법은 형광 표지된 세포가 배경과 쉽게 구별될 수 있기 때문에 자동 세포 추적을 위한 이점을 제공하는 위상 대조 현미경 검사법을 대체할 수 있습니다. 또 다른 장점은 면역 세포의 특정 집단은 형광 항체로 표면 마커를 표지 한 후에 선택적으로 추적 될 수 있다는 것입니다. 우리는 인간 말초 혈액 CD14+ 세포 (단핵구)가 화학 전술 fMLP (N-formylmethionine-leucyl-phenylain) 그라데이션38에서이동하는 이미지인간 말초 혈액에 이 접근법을 사용했다. 유사하게, 형광 항 F4/80 항체는 화학적 보체 C5a 구배를 보완하는 마우스 대식세포를 이미지화하는데 사용될 수 있었다. 광독성은 형광이미징(41)을사용하는 잠재적 단점이다. 이는 더 긴 파장으로 흥분된 형광단을 사용하고 배지에 항산화제를 추가하는 것을 포함하여 다양한 수단42에의해 감소될 수 있다. 대안적으로, 표지된 세포는 처음에 형광 현미경 검사법에 의해 확인되고 시간 경과, 위상 대조 현미경 검사법에 의해 그 후에 심상될 수 있었습니다. 그러나 실제로, 세포는 ~ 1 μm / min (대식세포) 또는 ~ 4 μm / min (단핵구)과 같은 적당히 낮은 속도로 이동하는 세포는 분 간격으로 형광 현미경 검사법에 의해 간헐적으로 이미지 화 될 수 있으며, 이는38을잘 견딜 수 있습니다. 우리는 이전에 형광 현미경 검사법을 사용하고 3D 화학변성 검사법38,,43에대해 여기에 기술된 화학탁증 슬라이드를 사용했습니다. 이 때, 두 저수지 모두 배지 및 15 μL 화학유량 함유 배지로 미리 채워졌으며, 형광표지세포를 서서히 배관하기 직전에 저수지 중 하나에 끌어당기고 콜라겐 타입 I을 함유하는 배지에 매질하였다. 이 절차의 어려운 부분은 산성 용액에 농축된 콜라겐 유형 I의 취급입니다. 콜라겐 용액의 pH는 알칼리성 용액을 첨가하여 중화되어야 하며, 얼음-차가운 콜라겐 용액을 세포 현탁액과 혼합한다. 37°C에서 인큐베이터로 콜라겐 세포 혼합물을 전달하면 콜라겐 중합을 개시할 것이다. 배양 하는 동안, 슬라이드 는 천천히 그것의 긴 축 주위 회전 해야 세포는 X-, Y-및 Z 축 방향으로 균등 하 게 분포 유지 콜라겐 젤으로 중합 하는 동안. 3D 화학요법 에 적합한 관련 폐쇄된 화학전염 슬라이드는, 4개의 플러그 대신에 6개의 플러그를 가진, 최근에29를기술되었습니다. 이 시스템은 각 저수지에 단일 포트가 아닌 두 개의 충전 포트가 있기 때문에 각 측면 저장소를 독립적으로 채우기 전에 콜라겐 세포 혼합물을 관찰 영역으로 도입 할 수 있습니다.
요약하면, 우리는 6 시간 이상의 기간 동안 화학 전술 구배에서 탐색하는 세포의 시각화를 허용하는 실시간 화학 변사 분석법을 설명합니다. 여기서 우리는 염증성 질환에서 중요한 역할을 하지만 호중구 및 Dictyostelium 아메바와 같은 더 빠른 이동 세포에 비해 실시간 화학탁증 분석법에서 과소 대표된 대식세포에 초점을 맞추고 있다.
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 DFG (도이치 포르충스게마인샤프트)의 보조금(HA 3271/3-2)에 의해 지원되었다.
µ-Slide (anodized aluminium) rack | Ibidi, Martinsried, Germany | 80003 | Autoclavable stackable rack for channel slides |
µ-Slide Chemotaxis 2D (chemotaxis slide) | Ibidi, Martinsried, Germany | 80306 | Slide containing chemotaxis chambers (tissue culture treated) |
100x penicillin/streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Used as supplement for RPMI 1640 media |
10-100 µL pipette with volume control ring | Eppendorf | 3123000047 | Eppendorf Research plus pipette |
10-200 µL pipette tips | Greiner Bio-One International | 739261 | Pipette tips with beveled tips (96 pieces per rack: sterile) |
14 ml polypropylene round bottom tubes | BD Falcon | 352059 | Used to collect peritoneal cells |
14-bit Hamamatsu C9100-50 Electron Multiplying-Charged Couple Device (EM-CCD) peltier-cooled camera | Hamamatsu Photonics Inc., Japan | EM-CCD camera of the spinning disk confocal microscope system | |
2-20 µL pipette with volume control ring | Eppendorf | 3123000039 | Eppendorf Research plus pipette |
24-G plastic catheter | B Braun Mesungen AG, Germany | 4254503-01 | Used for peritoneal lavage |
405 nm solid state laser, 50 mW | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | Laser (405 nm) source of spinning disk confocal microscope system | |
488 nm solid state laser, 50 mW | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | Laser (488 nm) source of spinning disk confocal microscope system | |
561 nm solid state laser, 50 mW | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | Laser (561 nm) source of spinning disk confocal microscope system | |
Alexa Fluor 488-conjugated rat (IgG2a) monoclonal (clone BM8) anti-mouse F4/80 antibody | Thermo Fisher Scientific | MF48020 | Mouse macrophage marker and plasma membrane label |
Alexa Fluor 594-conjugated rat (IgG2a) monoclonal (clone 6D5) anti-mouse CD19 antibody | BioLegend | 115552 | Mouse B cell marker |
C-Chip disposable (improved Neubauer) hemocytometer | NanoEnTek (distributed by VWR International) | 631-1098 | Used to count cells |
CSU-X1 spinning disk scanner | Yokogawa Electric Corporation, Japan | Nipkow spinning disk unit | |
Hank’s buffered salt solution without Ca2+ and Mg2+ | Thermo Fisher Scientific | 14170120 | Used for peritoneal lavage |
Heat-inactivated fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 10082139 | Used as supplement for RPMI 1640 media |
Hoechst 34580 | Thermo Fisher Scientific | H21486 | Cell permeable, blue fluorescent nucleic acid stain |
ImageJ (image processing and analysis in Java) | National Institutes of Health (NIH) | Image analysis software | |
Lipopolysaccharides from Escherichia coliO111:B4 | Sigma-Aldrich | L4391-1MG | Toll-like receptor 4 ligand |
Nikon Eclipse Ti inverse microscope | Nikon, Japan | Inverted microscope | |
Patent Blue V, sodium salt | Sigma-Aldrich | 21605-10G | Blue-colored dye used as visual indicator of gradient formation |
Recombinant mouse complement C5a protein | R&D Systems | 2150-C5-025 | Chemoattractant for mouse macrophages |
RPMI 1640 medium containing 20 mM Hepes | Sigma-Aldrich | R7388 | Basis medium for assays |
UltraVIEW Vox 3D live cell imaging system + Volocity software | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | Spinning disk confocal microscope system | |
Zeiss LSM 510 + Axiovision software | Carl Zeiss Microscopy, Oberkochen, Germany | Confocal laser scanning microscope (LSM) adapted for phase-contrast microscopy |