Hier beschrijven we methoden met behulp van time-lapse, fase-contrast microscopie om de muis ingezetene peritoneale macrofagen beeld in een chemotactische aanvulling C5a gradiënt. De protocollen kunnen worden uitgebreid naar andere immuuncellen.
Chemotaxis is receptor-gemedieerde begeleiding van cellen langs een chemische gradiënt, terwijl chemokinese is de stimulatie van willekeurige cel beweeglijkheid door een chemische stof. Chemokinese en chemotaxis zijn van fundamenteel belang voor de mobilisatie en inzet van immuuncellen. Chemokines (chemotactische cytokines) kunnen bijvoorbeeld snel circulerende neutrofielen en monocyten rekruteren naar extravasculaire ontstekingslocaties. Chemoattractant receptoren behoren tot de grote familie van G eiwit-gekoppelde receptoren. Hoe chemoattractant (d.w.z., ligand) gradiënten directe celmigratie via G eiwit-gekoppelde receptor signalering is nog niet volledig begrepen. Op het gebied van immunologie zijn neutrofielen populaire modelcellen voor het bestuderen van chemotaxis in vitro. Hier beschrijven we een real-time tweedimensionale (2D) chemotaxis test op maat voor muis resident macrofagen, die traditioneel moeilijker te bestuderen. Macrofagen bewegen in een langzaam tempo van ~ 1 μm/min op een 2D-oppervlak en zijn minder geschikt voor point-source migratietesten (bijvoorbeeld migratie naar het puntje van een micropipet gevuld met chemoattractant) dan neutrofielen of Dictyostelium discoideum, die een orde van grootte sneller bewegen. Op grote schaal gebruikt Transwell testen zijn nuttig voor het bestuderen van de chemotactische activiteit van verschillende stoffen, maar bieden geen informatie over cel morfologie, snelheid, of chemotactische navigatie. Hier beschrijven we een time-lapse microscopie-gebaseerde macrofaag chemotaxis test die kwantificering van de celsnelheid en chemotactische efficiëntie mogelijk maakt en biedt een platform om de transducers, signaaltrajecten en effectoren van chemotaxis af te definiëren.
Immuuncellen migreren meestal afzonderlijk op een 2D-oppervlak op een amoebe manier1,2, wat gepaard gaat met herhaalde cycli van uitsteeksel van de voorkant, integrin-gemedieerde celhechting, en intrekking van de achterzijde. Een vereiste stap is celpolarisatie, waarbij cellen voor- en achtereinden vormen3. Chemotaxis begint met de detectie van chemoattractants door G-eiwitgekoppelde receptoren en een complex signaleringsnetwerk dat wordt gebemiddeld door membraanverankerde hetero-trimmeric G-eiwitten en kleine monomeric G-eiwitten, evenals fosfolipidengebonden guanine nucleotide-uitwisselingsfactoren (GEFs)4,5. Activering van Rho GTPases van de Cdc42 en Rac subfamilies induceren uitsteeksels aan de voorzijde6 en leden van de Rho subfamilie, met name RhoA, activeren contractie van de achterzijde5,7. In een driedimensionale (3D) omgeving, integrins zijn grotendeels overbodig voor leukocyten migratie en RhoA wordt belangrijker voor het knijpen van cellen door smalle passages8, terwijl Cdc42- of Rac-geïnduceerde Arp2 / 3 activering blijft belangrijk voor chemotactische besturing9,10.
Immuuncellen kunnen worden geconfronteerd met verschillende chemoattractants, vooral in de instellingen van weefselletsel, pathogene invasie, en ontsteking. De endogene chemoattractanten uitgedrukt op fagocyten vullen C3a en C5a aan, worden snel gegenereerd door activering van de complementcascade en worden herkend door complementc3a- en C5a-receptoren. Op dezelfde manier rekruteren necrotische cellen fagocyten via formylpeptidereceptoren, die mitochondriën-afgeleide en bacteriën-afgeleide formyl peptiden11herkennen. Immuuncellen drukken ook G-eiwit-gekoppelde receptoren voor chemokines uit, een grote familie van chemoattractant peptiden die betrokken zijn bij de regulatie van immuuncelhandel tijdens zowel homeostase als ontsteking. Chemokines worden ingedeeld in vier groepen, afhankelijk van de afstand van de eerste twee cysteïne (C) residuen: C, CC, CXC, en CX3C cytokines, waar X is een aminozuur. Zo moeten in vivo immuuncellen adequaat reageren op zeer complexe ruimtelijke en temporele signalen, waardoor de studie van chemotaxis een ontmoedigende taak is. Hieronder geven we een korte geschiedenis van chemotaxis, die begon met intravital imaging benaderingen.
De studie van leukocyten chemotaxis dateert uit 188812, toen de oogarts Theodor Karl Gustav Leber duidelijk de gerichte migratie van leukocyten naar, en de accumulatie op, plaatsen van ontsteking in een model van mycotische (schimmel) keratitis beschreef. Leber benadrukte dat de aantrekkingskracht van overtollige leukocyten door pathogene stoffen belangrijk is voor de eliminatie van schadelijke micro-organismen via phagocytose, die eerder in hetzelfde decennium13was beschreven door Metchnikoff (ook bekend als Metschnikoff). In vivo experimenten werden ook uitgevoerd in de jaren 1920 door Clark en Clark14,15, die gebruik maakten van de transparantie van kikkervisjes en toonde dat steriele ontsteking veroorzaakt door croton olie14 of andere irriterende stoffen15 veroorzaakt leukocyten aan bloedvaten, gevolgd door diapedesis (transendotheel migratie) en snelle migratie door de weefselruimten naar de irriterende. In vitro experimenten met behulp van de microcinematografie methode ontwikkeld door Jean Comandon16 bleek dat leukocyten gemigreerd naar een deeltjes chemoattractant bron zoals bacteriën17. Op dat moment waren de moleculaire identiteiten van chemotactische factoren onbekend. In de jaren 1960, Stephen Boyden18 erkend dat technieken om de chemotactische activiteit van oplosbare stoffen te bestuderen ontbraken. Hij bedacht een kamer, later bekend als de Boyden kamer, met twee compartimenten gescheiden door een filter papier membraan. Aan het bovenste compartiment wordt een celvering toegevoegd en de teststof wordt aan beide compartimenten of alleen aan het onderste compartiment toegevoegd. Na een incubatietijd wordt het filtermembraan verwijderd en worden de cellen bevestigd en gekleurd. Door te vergelijken hoeveel cellen migreren over het filtermembraan naar de onderste put met de teststof in beide compartimenten, in geen van beide compartimenten, of alleen in het onderste compartiment, chemotactische activiteit kan worden bepaald. Transwell assays zijn nog steeds populair vandaag en zijn gewijzigd op verschillende manieren, met inbegrip van het gebruik van verschillende polycarbonaat membranen met gedefinieerde porie maten en dichtheden19,20. Een groot nadeel van Transwell-testen is dat het onpraktisch is om cellen die migreren direct te visualiseren en dat het migratiepad over het membraan doorgaans niet hoger is dan de diameter van een immuuncel.
Sally H. Zigmond ontwikkelde een chemotaxis kamer21 die visualisatie van zowel gradiëntvorming als celmorfologie mogelijk maakte met fluorescerende kleurstoffen. De kamer bestaat uit een plexiglas (acryl) dia met twee parallelle lineaire putten, elk met een volume van ~ 100 μL, gescheiden door een 1 mm brede brug 3-10 μm onder het bovenste vlak van de dia. Een coverslip gezaaid met cellen wordt omgekeerd en geplaatst op de dia zodanig dat het de twee putten omspant. Na toevoeging van een chemoattractant aan een van de putten, vormt zich een steile chemoattractante gradiënt over de brug, meestal binnen 30-90 min. Menselijke polymorfnucleaire leukocyten (granulocyten) in de Zigmond-kamer worden waargenomen zich te oriënteren op de chemoattractant. Variaties van de Zigmond kamer zijn gemeld, met inbegrip van de Dunn22 en Insall23 kamers, die beide gebruik maken van een coverslip gezaaid met cellen geplaatst over twee putten gescheiden door een 1 mm brede brug. De Dunn kamer bestaat uit concentrische putten gescheiden door een ronde brug, terwijl de Insall kamer is nauwer verwant aan de Zigmond kamer, maar biedt bruggen van twee verschillende breedtes, 0,5 mm en 1 mm. Een nieuwe chemotaxis kamer, genoemd μ-Slide Chemotaxis en vervaardigd door plastic spuitgieten, werd beschreven door Zemgel et al.24. De chemotaxis kamer bestaat uit twee 40 μL reservoirs gescheiden door een 1 mm breed kanaal met een lengte van 2 mm en een hoogte van 70 μm. De onderkant van de kamer wordt gevormd door een gasdoorlatende, dunne kunststof plaat met dezelfde dikte en optische eigenschappen van een nr. 1,5 glazen afdekking24. Hier beschrijven we een chemotaxis test met behulp van de μ-Slide Chemotaxis kamer om de migratie van muis ingezetene peritoneale macrofagen te visualiseren voor maximaal 14 uur in een chemotactische (complement C5a) gradiënt.
Intravital imaging dateert uit de 19e eeuw en biedt een middel om het gedrag van levende immuuncellen in hun natuurlijke omgeving te bestuderen. Echter, zelfs met de geavanceerde microscopie van vandaag en genetische technieken is het moeilijk om de reactie van cellen op specifieke chemoattractants in vivo te bestuderen. Om dit probleem te omzeilen, boyden18 ontwikkeld Transwell testen in de jaren 1960, maar deze eindpunt testen niet visualisatie van hoe cellen daadwerkelijk gemigreerd naar chemoattractants, waardoor het moeilijk is om chemokinese te onderscheiden, gestimuleerd willekeurige migratie door een chemische cue32, en chemotaxis, migratie naar hogere concentraties van chemische stimuli van elkaar33. Dit probleem werd opgelost door het ontwerpen van verschillende open kamers met een brug, meestal 1 mm breed, gelegen tussen twee reservoirs en toegankelijk door een objectieve lens21,22,23. Het aanbrengen van een omgekeerde afdekking slip, gezaaid met aanhangende cellen, sluit de kamers en chemoattractant toegevoegd aan een van de reservoirs verspreidt zich over de brug naar de tegengestelde reservoir, het creëren van een concentratie gradiënt. Hier beschrijven we een chemotaxis test met behulp van hetzelfde principe, maar met behulp van een gesloten kamer met vier vulpoorten. Met behulp van dit systeem en time-lapse, fase-contrast microscopie, ontwikkelden we een test om muis ingezetene peritoneale macrofagen migreren in een chemotactische aanvulling C5a gradiënt31,34,35,36. Deze test, gecombineerd met knock-out muis modellen, bleek instrumenteel in het onderzoek naar de rollen van verschillende Rho GTPases en motoreiwitten in macrofaag morfologie, beweeglijkheid, en chemotaxis31,34,35,36,37. We hebben ook gebruik gemaakt van deze benadering van beeld menselijke perifere bloed monocyten migreren op een 2D-oppervlak of in een 3D collageen type I matrix38. Bovendien is de test geschikt voor muisbeenmerg-afgeleide macrofagen of macrofagen afgeleid van voorwaardelijk vereeuwigde myeloïde voorlopercellen39,40. We hebben eerder polytetrafluorethyleen (PTFE) zakken met luer adapters gebruikt om beenmergcellen te kweken en macrofagen te verkrijgen34. Het voordeel van PTFE zakken is dat de cellen gemakkelijk kunnen worden opgehangen en klaar voor gebruik na het plaatsen van de zak op ijs voor 20-30 min. Merk op dat we prefill de chemotaxis dia observatiegebied voor de invoering van de cellen. Deze aanpak heeft als voordeel dat ongewenste luchtbellen vervolgens kunnen worden weggespoeld (met wisselend succes) en het voorgeweekte observatiegebied maakt de langzame introductie van een celvering mogelijk door te pipetteren. Voorvulling, hoewel, verhoogt de kans dat het medium gedeeltelijk zal stromen in een of beide van de flankerende reservoirs, die het zaaien van cellen buiten het observatiegebied zal bevorderen. Als alternatief kan de celsuspensie direct in een droog observatiegebied worden gepipeterd, maar ongewenste luchtbellen kunnen vervolgens niet worden uitgezet.
De peritoneale holte van de muis bevat twee hoofdpopulaties van cellen: F4/80+ macrofagen en (kleinere) CD19+ B-cellen, met een verhouding van ongeveer 1:2 (figuur 4A). Deze twee celpopulaties zijn goed voor meer dan 95% van de peritoneale holtecellen, terwijl de resterende F4/80–/CD19– cellen meestal kunnen worden geïdentificeerd als CD11c+ cellen (dendritische cellen) of CD3+ cellen (T-cellen). Zwak aanhangende B-cellen worden tijdens het vullen van de reservoirs met het medium(figuur 2)uit het observatiegebied gewassen. Na het toevoegen van chemoattractant aan een van de twee reservoirs, time-lapse, fase-contrast microscopie kan worden gebruikt om het beeld van de resterende cellen (macrofagen) migreren in een evoluerende chemoattractant gradiënt. De vorming van de complementC5a gradiënt in het observatiegebied, via diffusie van het ene reservoir naar het andere, kan worden gesimuleerd met behulp van een fluorescerende kleurstof met een vergelijkbaar moleculair gewicht. Een goede vervanger voor recombinante muis complement C5a (voorspeld moleculair gewicht, 9,0 kDa) is fluorescerend gelabeld dextran (10 kDa)31. Met behulp van confocale microscopie kan het fluorescentieverloop in het smalle kanaal (observatiegebied) dat de twee reservoirs van de chemotaxis-glijbaan met elkaar verbindt, met vaste intervallen worden gemeten en kunnen concentratieprofielen op de verschillende tijdstippen24,31worden uitgezet . We voegen routinematig een niet-fluorescerende, blauwe kleurstof (Patent Blue V) toe aan het chemoattractant medium om een handige visuele indicator van diffusie en gradiëntvorming te bieden. Binnen 1 uur na de introductie van 15 μL blauw, chemoattractant-bevattend medium in een reservoir, lijkt het reservoir gelijkmatig blauw en, volgens fick’s diffusiewetten, vormt zich een gradiënt over het smalle observatiegebied dat de reservoirs met elkaar verbindt (figuur 3B). Er zijn meerdere dagen nodig om de oplosmiddel (blauwe kleurstof of chemoattractant) gelijkmatig te verdelen.
Fluorescentiemicroscopie kan worden vervangen door fasecontrastmicroscopie, wat voordelen biedt voor geautomatiseerde celtracking, omdat fluorescerende gelabelde cellen gemakkelijk van de achtergrond kunnen worden onderscheiden. Een ander voordeel is dat specifieke populaties immuuncellen selectief kunnen worden gevolgd na het labelen van oppervlaktemarkers met fluorescerende antilichamen. We gebruikten deze benadering van beeld menselijk perifere bloed CD14+ cellen (monocyten) migreren in een chemotactische fMLP (N-formylmethionine-leucyl-fenylalanine) gradiënt38. Op dezelfde manier kunnen fluorescerende anti-F4/80-antilichamen worden gebruikt om muismacrofagen te afbeelding die migreren in een chemotactische complement C5a-gradiënt. Fototoxiciteit is een potentieel nadeel van het gebruik van fluorescentiebeeldvorming41. Dit kan worden verminderd met verschillende middelen42, met inbegrip van het gebruik van fluorophores opgewonden met langere golflengten en het toevoegen van antioxidanten aan het medium. Als alternatief konden gelabelde cellen in eerste instantie worden geïdentificeerd door fluorescentiemicroscopie en vervolgens in beeld worden gebracht door time-lapse, fasecontrastmicroscopie. In de praktijk kunnen cellen die bewegen bij matig lage snelheden, zoals ~1 μm/min (macrofagen) of ~4 μm/min (monocyten), echter met tussenpozen worden afgebeeld door fluorescentiemicroscopie met intervallen van minuten, wat goed wordt verdragen38. We gebruikten eerder fluorescentie microscopie en de chemotaxis dia hier beschreven voor 3D chemotaxis testen38,43. In dit geval werden beide reservoirs voorgevuld met medium en 15 μL chemoattractant-bevattende medium werd getrokken in een van de reservoirs onmiddellijk voordat langzaam pipetteren fluorescerend gelabelde cellen opgehangen in medium met collageen type I in het observatiegebied. Het moeilijke deel van deze procedure is de behandeling van collageen type I, dat is geconcentreerd in zure oplossing. De pH van de collageenoplossing moet worden geneutraliseerd door toevoeging van alkalische oplossing voordat u de ijskoude collageenoplossing mengt met de celsuspensie. De overdracht van het collageencelmengsel naar een couveuse bij 37 °C zal de polymerisatie van collageen in gang zetten. Tijdens de incubatietijd moet de dia langzaam rond zijn lange as worden gedraaid, zodat de cellen gelijkmatig verdeeld blijven in de X-, Y- en Z-as richtingen, terwijl het collageen polymeriseert in een gel. Een verwante gesloten chemotaxis dia geschikt voor 3D chemotaxis testen, met zes stekkers in plaats van vier stekkers, is onlangs beschreven29. Dit systeem maakt het mogelijk het collageen-celmengsel in het observatiegebied te brengen voordat het elk van de flankerende reservoirs onafhankelijk vult, omdat elk reservoir twee vulpoorten heeft, in plaats van één enkele poort.
Samengevat beschrijven we een real-time chemotaxis-test die het mogelijk maakt om cellen te visualiseren die in een chemotactische gradiënt navigeren gedurende een periode van 6 of meer uur. Hierin richten we ons op macrofagen, die een grote rol spelen bij ontstekingsziekten, maar zijn ondervertegenwoordigd in real-time chemotaxis testen in vergelijking met sneller bewegende cellen zoals neutrofielen en Dictyostelium amoebe.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door een subsidie (HA 3271/3-2) van de DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft).
µ-Slide (anodized aluminium) rack | Ibidi, Martinsried, Germany | 80003 | Autoclavable stackable rack for channel slides |
µ-Slide Chemotaxis 2D (chemotaxis slide) | Ibidi, Martinsried, Germany | 80306 | Slide containing chemotaxis chambers (tissue culture treated) |
100x penicillin/streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Used as supplement for RPMI 1640 media |
10-100 µL pipette with volume control ring | Eppendorf | 3123000047 | Eppendorf Research plus pipette |
10-200 µL pipette tips | Greiner Bio-One International | 739261 | Pipette tips with beveled tips (96 pieces per rack: sterile) |
14 ml polypropylene round bottom tubes | BD Falcon | 352059 | Used to collect peritoneal cells |
14-bit Hamamatsu C9100-50 Electron Multiplying-Charged Couple Device (EM-CCD) peltier-cooled camera | Hamamatsu Photonics Inc., Japan | EM-CCD camera of the spinning disk confocal microscope system | |
2-20 µL pipette with volume control ring | Eppendorf | 3123000039 | Eppendorf Research plus pipette |
24-G plastic catheter | B Braun Mesungen AG, Germany | 4254503-01 | Used for peritoneal lavage |
405 nm solid state laser, 50 mW | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | Laser (405 nm) source of spinning disk confocal microscope system | |
488 nm solid state laser, 50 mW | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | Laser (488 nm) source of spinning disk confocal microscope system | |
561 nm solid state laser, 50 mW | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | Laser (561 nm) source of spinning disk confocal microscope system | |
Alexa Fluor 488-conjugated rat (IgG2a) monoclonal (clone BM8) anti-mouse F4/80 antibody | Thermo Fisher Scientific | MF48020 | Mouse macrophage marker and plasma membrane label |
Alexa Fluor 594-conjugated rat (IgG2a) monoclonal (clone 6D5) anti-mouse CD19 antibody | BioLegend | 115552 | Mouse B cell marker |
C-Chip disposable (improved Neubauer) hemocytometer | NanoEnTek (distributed by VWR International) | 631-1098 | Used to count cells |
CSU-X1 spinning disk scanner | Yokogawa Electric Corporation, Japan | Nipkow spinning disk unit | |
Hank’s buffered salt solution without Ca2+ and Mg2+ | Thermo Fisher Scientific | 14170120 | Used for peritoneal lavage |
Heat-inactivated fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 10082139 | Used as supplement for RPMI 1640 media |
Hoechst 34580 | Thermo Fisher Scientific | H21486 | Cell permeable, blue fluorescent nucleic acid stain |
ImageJ (image processing and analysis in Java) | National Institutes of Health (NIH) | Image analysis software | |
Lipopolysaccharides from Escherichia coliO111:B4 | Sigma-Aldrich | L4391-1MG | Toll-like receptor 4 ligand |
Nikon Eclipse Ti inverse microscope | Nikon, Japan | Inverted microscope | |
Patent Blue V, sodium salt | Sigma-Aldrich | 21605-10G | Blue-colored dye used as visual indicator of gradient formation |
Recombinant mouse complement C5a protein | R&D Systems | 2150-C5-025 | Chemoattractant for mouse macrophages |
RPMI 1640 medium containing 20 mM Hepes | Sigma-Aldrich | R7388 | Basis medium for assays |
UltraVIEW Vox 3D live cell imaging system + Volocity software | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | Spinning disk confocal microscope system | |
Zeiss LSM 510 + Axiovision software | Carl Zeiss Microscopy, Oberkochen, Germany | Confocal laser scanning microscope (LSM) adapted for phase-contrast microscopy |