ここでは、C5a勾配を化学戦術補体で画像マウス常駐腹膜マクロファージにタイムラプス、位相コントラスト顕微鏡を用いた方法について説明する。プロトコルは、他の免疫細胞に拡張することができます。
化学勾配に沿った細胞の受容体媒介誘導であるのに対し、ケモカイン症は化学物質によるランダムな細胞運動の刺激である。ケモキネシスとケモタクシスは、免疫細胞の動員と展開の基本です。例えば、ケモカイン(化学戦術サイトカイン)は、循環性好中球および単球を炎症の血管外部位に迅速にリクルートすることができる。化学誘起受容体は、Gタンパク質共役受容体の大家族に属する。化学誘起剤(すなわち、リガンド)がGタンパク質共役受容体シグナル伝達を介して細胞を直接移動する勾配は、まだ完全には理解されていない。免疫学の分野では、好中球は、体外での走気学を研究するための一般的なモデル細胞です。ここでは、従来より研究が困難であったマウス常駐マクロファージに合わせたリアルタイム2次元(2D)気道化アッセイについて説明します。マクロファージは、2D表面上で〜1μm/分のゆっくりとしたペースで移動し、好中球やジクチオステリウム・ディスコジドムよりもポイントソース移行アッセイ(例えば、化学誘引剤で満たされたマイクロピペットの先端に向かって移動する)にはあまり適していません。広く使用されているトランスウェルアッセイは、異なる物質の化学戦術活性を研究するのに有用であるが、細胞の形態、速度、または化学戦術ナビゲーションに関する情報を提供しない。ここでは、細胞速度と化学戦術効率の定量化を可能にし、トランスデューサ、シグナル経路、および気体のエフェクターを描写するプラットフォームを提供するタイムラプス顕微鏡ベースのマクロファージ化学体系アッセイについて説明する。
免疫細胞は、典型的には、アメーブ様式の,2D表面上で1回に1回移動する、これは、前部の突出、インテグリン媒介細胞接着、および後部の後退の繰り返しサイクルを伴う。前提条件となるステップはセル偏光で、セルは前後の端部3を形成します。化学療法は、Gタンパク質共役受容体による化学誘引物質の検出と、膜固定ヘテロトリメリックGタンパク質および小さな単量体Gタンパク質、ならびにリン脂質結合グアニンヌクレオチド交換因子(GIF)4,5によって媒介される複雑なシグナル伝達4,5ネットワークから始まる。Cdc42およびRacサブファミリーのRho GTPasesの活性化は、前方6およびRhoサブファミリーのメンバー、特にRhoAで突起を誘発し、後部55,77の収縮を活性化する。3次元(3D)環境では、インテグリンは白血球の移動に対して大部分が冗長であり、RhoAは狭い通路8を通して細胞を圧迫するためにより重要になるが、Cdc42またはRac誘発Arp2/3活性化は、化学戦術ステアリング99、1010にとって依然として重要である。
免疫細胞は、特に組織損傷、病原体の侵入、および炎症の設定において、異なる化学誘引物質に直面する可能性があります。食細胞補体C3aおよびC5a上で発現される内因性化学誘引物質は、補体カスケードの活性化によって急速に生成され、そして補体C3aおよびC5a受容体によって認識される。同様に、壊死細胞は、ホルミルペプチド受容体を介して食細胞をリクルートし、これはミトコンドリア由来のペプチドと同様に細菌由来のホルミルペプチド11を認識する。免疫細胞はまた、ホメオシンの両方の間に免疫細胞の人身売買の調節に関与する化学誘引ペプチドの大家族であるケモカインのGタンパク質結合受容体を発現する。ケモカインは、最初の2つのシステイン(C)残基の間隔に応じて4つのグループに分類されます:C、CC、CXC、およびCX3Cサイトカイン、Xはアミノ酸です。したがって、生体内免疫細胞は、非常に複雑な空間的および時間的な信号に適切に応答する必要があり、走性の研究は困難な作業になります。以下は、生体内イメージングアプローチから始まった、走性の簡単な歴史を提供します。
白血球の化学薬は1888年12年にさかのぼり、眼科医のテオドール・カール・グスタフ・レーバーが、白血球の指向性移動と、真菌性(真菌)角膜炎のモデルにおける炎症部位の蓄積を明確に説明した。リーバーは、病原体由来物質による過剰な白血球の引力は、同じ13年にメチニコフ(メッチニコフとも呼ばれる)によって説明されていた食作用による有害な微生物の排除にとって重要であることを強調した。1920年代には、クラークとクラーク14(15),15によっても実験が行われ、オタマジャクシの透明性を利用して、クロトンオイル14または他の刺激物15によって誘発された無菌炎症が15原因で白血球が血管に付着し、続いて下垂体(経内皮移動)および刺激剤に向かって組織空間を迅速に移動することが示された。ジャン・コマンドン16によって開発されたマイクロシネマトグラフィー法を用いたインビトロ実験は、白血球が細菌17のような粒子状の化学誘引物質源に向かって移行することを示した。当時、化学戦術因子の分子同一性は不明であった。1960年代、スティーブン・ボイデン18は、可溶性物質の化学戦術活性を研究する技術が欠けていることを認識しました。彼は、その後ボイデンチャンバーとして知られている部屋を考案し、2つのコンパートメントを濾紙膜で分離しました。細胞懸濁液は上部コンパートメントに加え、被検物質は両方のコンパートメントまたは下部コンパートメントにのみ追加されます。インキュベーション期間の後、フィルター膜を除去し、細胞を固定して染色します。フィルター膜を横切って低いウェルに向かって移動する細胞の数を、両方のコンパートメントの被検物質と比較することによって、どちらのコンパートメントでも、または下部のコンパートメント内でのみ、化学戦術活性を決定することができる。トランスウェルアッセイは、現在でも人気があり、定義された細孔サイズと密度19、20,20を有する異なるポリカーボネート膜の使用を含む様々な方法で変更されています。トランスウェルアッセイの大きな欠点は、細胞の移動を直接可視化することは現実的ではなく、膜を横切る移動経路は通常、免疫細胞の直径を超えないということです。
サリー・H・ジグモンドは、蛍光色素を用いた勾配形成と細胞形態の両方の可視化を可能にする化学顔軸チャンバー21を開発した。チャンバーは、2つの平行な線形ウェルを備えたプレキシガラス(アクリル)スライドで構成され、それぞれ体積は〜100 μLで、スライドの上面より3〜10μm下の1mm幅のブリッジで区切られています。細胞で播種されたカバースリップは反転され、それが2つの井戸にまたがるようにスライドに置かれる。井戸の1つに化学誘引剤を添加した後、橋を渡る急な化学誘引勾配が形成され、通常は30〜90分以内に、ジグモンド室のヒト多形核白血球(顆粒球)が化学誘引剤に向かって観察される。ジグモンド室のバリエーションは、ダン22とインソール23チャンバーを含む報告されており、どちらも1mm幅の橋で分離された2つの井戸に配置された細胞で播種されたカバースリップを使用しています。ダンチャンバーは円形の橋で区切られた同心円の井戸で構成されていますが、インソール室はジグモンド室とより密接に関連していますが、0.5mmと1mmの2つの異なる幅の橋を提供します。新しい気化チャンバーを、μ-スライド・ケモタクシスと呼び、プラスチック射出成形によって製造した、Zemgelら24.この気胸室は、長さ2mm、高さ70μmの1mm幅チャネルで隔てられた2つの40μL貯留層から構成されています。チャンバの底部は、1.5号ガラスカバースリップ24と同じ厚さと光学特性を有するガス透過性の薄いプラスチックシートによって形成される。ここでは、μ-Slide Chemotaxisチャンバーを用いて、マウス常駐腹膜マクロファージの移動を化学戦術(補数C5a)勾配で最大14時間可視化する気胸アッセイについて説明する。
インビタルイメージングは19世紀にさかのぼり、自然環境における生きている免疫細胞の行動を研究する手段を提供します。しかし、今日の高度な顕微鏡や遺伝的手法を用いても、生体内の特定の化学誘引物質に対する細胞の反応を研究することは困難です。この問題を回避するために、Boyden18は1960年代にトランスウェルアッセイを開発しましたが、これらの終点アッセイは細胞が実際に化学誘引物質に移行する方法を視覚化しておらず、ケモキネシスを区別することが困難になり、化学キュー32によるランダムな移動を刺激し、化学的刺激物の高濃度に向かって移動します33.この問題は、橋を持つ様々な開放室を設計することによって解決されました, 通常1ミリメートル幅, 2つの貯水池の間に位置し、対物レンズ21、22、23,22,23でアクセス可能です。付着細胞を播種した反転カバースリップを適用すると、チャンバーを閉じ、貯水池の1つに加えた化学誘引剤が橋を横切って反対側の貯水池に拡散し、濃度勾配が生じます。ここでは、同じ原理を使用して、4つの充填ポートを備えた閉じたチャンバーを使用して、走気化アッセイについて説明します。このシステムとタイムラプス、位相コントラスト顕微鏡を用いて、我々は、C5aの勾配31、34、35、36,34,35の化学戦術補体で移動するマウス常駐腹膜マクロファージを画像化するアッセイを36開発した。このアッセイは、ノックアウトマウスモデルと組み合わせることで、マクロファージ形態、運動性、および化学,体質31、34、35、36、37,34における様々なRho GTPasesおよび運動タンパク質の役割の調査に役立つ。36,37,35我々はまた、このアプローチを用い、2D表面または3Dコラーゲン型Iマトリックス38で移動するヒト末梢血単球を画像化する。さらに、このアッセイは、条件付きで不死化骨髄前駆細胞39,40,40に由来するマウス骨髄由来マクロファージまたはマクロファージに適している。我々は以前に骨髄細胞を培養し、マクロファージ34を得るためにルアーアダプターとポリテトラフルオロエチレン(PTFE)バッグを使用しました。PTFEバッグの利点は、袋を氷の上に20〜30分間置いた後、細胞を容易に再懸濁して使用できるということです。このアプローチは、不要な気泡をその後(可変的な成功で)洗い流すことができるという利点を有し、予め浸された観察領域はピペットによって細胞懸濁液の遅い導入を可能にする。しかし、事前充填は、培地が部分的に隣接する貯水池の一方または両方に流れ込む可能性を高め、観察領域を越えて細胞の播種を促進する。あるいは、細胞懸濁液を乾燥観察領域に直接配管することができるが、不要な気泡は後で排出することができない。
マウスの腹膜腔には、F4/80+マクロファージおよび(より小さい)CD19+B細胞の2つの主要な集団+が含まれ、約1:2の比率で(図4A)。+これら2つの細胞集団は腹腔細胞の95%以上を占めるが、残りのF4/80-/CD19細胞は通常、CD11c+細胞(樹状細胞)または–CD3+細胞(T細胞)として+同定することができる。弱く付着したB細胞は、リザーバを培地で充填する際に観察領域から洗い流される(図2)。2つの貯水池のいずれかに化学誘引剤を添加した後、タイムラプス、位相コントラスト顕微鏡を使用して、進化する化学誘引勾配で移動する残りの細胞(マクロファージ)を画像化することができます。観察領域における補体C5a勾配の形成は、一方の貯蔵所から他方への拡散を介して、同様の分子量を有する蛍光色素を用いてシミュレートすることができる。組換えマウス補体C5a(予測分子量、9.0 kDa)の代用として優れた、デキストラン(10kDa)31に蛍光標識されている。31共焦点顕微鏡を用いて、狭いチャネル(観察領域)の2つの貯留層を結ぶ狭いチャネル(観察領域)を異なる時間点で一定の間隔および濃度プロファイルで測定することができ、24,3131をプロットすることができる。24化学誘引剤媒体に非蛍光性青色色素(Patent Blue V)を日常的に添加し、拡散と勾配形成の便利な視覚指標を提供しています。15 μLの青、化学誘起剤含有培地を貯水池に導入してから1時間以内に、貯留層は均一に青色に見え、フィックの拡散法則によれば、貯水池を結ぶ狭い観察領域に勾配が形成される(図3B)。溶質(青い染料または化学誘引剤)が均一に分布するために数日が必要です。
蛍光顕微鏡は、蛍光標識された細胞をバックグラウンドから容易に区別できるため、自動細胞追跡の利点を提供する位相対比顕微鏡の代用が可能です。もう一つの利点は、免疫細胞の特定の集団が蛍光抗体で表面マーカーを標識した後に選択的に追跡できることである。この手法を用い、ヒト末梢血CD14+細胞(単球)を化学戦術fMLP(N-ホルミルメチオニン-ロイシル-フェニルアラニン)勾配38で遊走する画像化に用いた。同様に、蛍光抗F4/80抗体は、化学戦術補体C5a勾配で遊走するマウスマクロファージを画像化するために使用することができる。光毒性は、蛍光イメージング41を用いるという潜在的な欠点である。これは、より長い波長で励起された蛍光色素を使用し、培地に抗酸化物質を添加することを含む様々な手段42によって減少させることができる。あるいは、標識された細胞は、蛍光顕微鏡によって最初に同定され、その後、タイムラプス、位相コントラスト顕微鏡によって画像化することができた。しかし、実際には、〜1μm/min(マクロファージ)や〜4μm/min(単球)のような適度に低い速度で移動する細胞は、微小間隔で蛍光顕微鏡で断続的に画像化することができ、これは十分に許容される38である。我々は、以前に3D化学軸アッセイ38、43のためにここで説明する蛍光顕微鏡と気化スライドを43使用した。この場合、両方のリザーバが、コラーゲン型I型を含む培地に浮遊する蛍光標識細胞を観察領域にゆっくりとピペットする直前に、培地および15μLの化学誘引物質含有培地を1つの貯留槽に引き込んだ。この手順の難しい部分は、酸性溶液に濃縮されたコラーゲンタイプIの取り扱いです。コラーゲン溶液のpHは、細胞懸濁液と氷冷コラーゲン溶液を混合する前にアルカリ溶液を添加して中和する必要があります。37°Cでインキュベーターにコラーゲン細胞混合物を移す、コラーゲン重合を開始します。インキュベーション中、スライドは長い軸の周りをゆっくりと回転させ、細胞がX軸、Y軸、Z軸方向に均等に分布したまま、コラーゲンがゲルに重合するようにします。3Dの化学療法アッセイに適した関連の閉じた気化スライドは、4つのプラグの代わりに6つのプラグを備え、最近29を説明した。このシステムは、各貯水池が単一のポートではなく2つの充填ポートを有するため、各貯蔵所を独立して充填する前に、コラーゲン細胞混合物を観察領域に導入することを可能にする。
要約すると、6時間以上にわたって化学戦術勾配でナビゲートする細胞の可視化を可能にするリアルタイムの走化アッセイについて述べた。ここでは、炎症性疾患において主要な役割を果たすが、好中球やジクチオステリウムアメーバのようなより速い移動細胞と比較してリアルタイムの化学式アッセイで過小評価されているマクロファージに焦点を当てています。
The authors have nothing to disclose.
この研究は、DFG(ドイツ・フォルシュングスゲマイヌシャフト)からの助成金(HA 3271/3-2)によって支えられた。
µ-Slide (anodized aluminium) rack | Ibidi, Martinsried, Germany | 80003 | Autoclavable stackable rack for channel slides |
µ-Slide Chemotaxis 2D (chemotaxis slide) | Ibidi, Martinsried, Germany | 80306 | Slide containing chemotaxis chambers (tissue culture treated) |
100x penicillin/streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Used as supplement for RPMI 1640 media |
10-100 µL pipette with volume control ring | Eppendorf | 3123000047 | Eppendorf Research plus pipette |
10-200 µL pipette tips | Greiner Bio-One International | 739261 | Pipette tips with beveled tips (96 pieces per rack: sterile) |
14 ml polypropylene round bottom tubes | BD Falcon | 352059 | Used to collect peritoneal cells |
14-bit Hamamatsu C9100-50 Electron Multiplying-Charged Couple Device (EM-CCD) peltier-cooled camera | Hamamatsu Photonics Inc., Japan | EM-CCD camera of the spinning disk confocal microscope system | |
2-20 µL pipette with volume control ring | Eppendorf | 3123000039 | Eppendorf Research plus pipette |
24-G plastic catheter | B Braun Mesungen AG, Germany | 4254503-01 | Used for peritoneal lavage |
405 nm solid state laser, 50 mW | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | Laser (405 nm) source of spinning disk confocal microscope system | |
488 nm solid state laser, 50 mW | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | Laser (488 nm) source of spinning disk confocal microscope system | |
561 nm solid state laser, 50 mW | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | Laser (561 nm) source of spinning disk confocal microscope system | |
Alexa Fluor 488-conjugated rat (IgG2a) monoclonal (clone BM8) anti-mouse F4/80 antibody | Thermo Fisher Scientific | MF48020 | Mouse macrophage marker and plasma membrane label |
Alexa Fluor 594-conjugated rat (IgG2a) monoclonal (clone 6D5) anti-mouse CD19 antibody | BioLegend | 115552 | Mouse B cell marker |
C-Chip disposable (improved Neubauer) hemocytometer | NanoEnTek (distributed by VWR International) | 631-1098 | Used to count cells |
CSU-X1 spinning disk scanner | Yokogawa Electric Corporation, Japan | Nipkow spinning disk unit | |
Hank’s buffered salt solution without Ca2+ and Mg2+ | Thermo Fisher Scientific | 14170120 | Used for peritoneal lavage |
Heat-inactivated fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 10082139 | Used as supplement for RPMI 1640 media |
Hoechst 34580 | Thermo Fisher Scientific | H21486 | Cell permeable, blue fluorescent nucleic acid stain |
ImageJ (image processing and analysis in Java) | National Institutes of Health (NIH) | Image analysis software | |
Lipopolysaccharides from Escherichia coliO111:B4 | Sigma-Aldrich | L4391-1MG | Toll-like receptor 4 ligand |
Nikon Eclipse Ti inverse microscope | Nikon, Japan | Inverted microscope | |
Patent Blue V, sodium salt | Sigma-Aldrich | 21605-10G | Blue-colored dye used as visual indicator of gradient formation |
Recombinant mouse complement C5a protein | R&D Systems | 2150-C5-025 | Chemoattractant for mouse macrophages |
RPMI 1640 medium containing 20 mM Hepes | Sigma-Aldrich | R7388 | Basis medium for assays |
UltraVIEW Vox 3D live cell imaging system + Volocity software | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | Spinning disk confocal microscope system | |
Zeiss LSM 510 + Axiovision software | Carl Zeiss Microscopy, Oberkochen, Germany | Confocal laser scanning microscope (LSM) adapted for phase-contrast microscopy |