Summary

Intravajinal HIV Maruziyeti ve HIV Enfeksiyonu Tedavisi için İnsanize NOG Fareler

Published: January 31, 2020
doi:

Summary

Biz nesil ve insanlaşmış ve insan immün yetmezlik virüs enfekte NOG fare modeli kök hücre nakli, intravajinal insan immün yetmezlik virüsü maruz kalma ve damlacık dijital PCR RNA dayalı değerlendirilmesi için bir protokol geliştirdik Miktar.

Abstract

Humanized fareler insan immün yetmezlik virüsü (HIV) virolojisi incelemek ve antiviral ilaçları test etmek için sofistike bir platform sağlar. Bu protokol yetişkin NOG farelerde bir insan bağışıklık sisteminin kurulması nı açıklar. Burada, göbek kordon kanı nın izolasyonundan elde edilen insan CD34+ hücrelerinin ve farelere intravenöz naklinden, modelin HIV enfeksiyonu yoluyla manipülasyonuna, kombinasyon antiretroviral tedaviye kadar tüm pratik adımları açıklıyoruz ( cART) ve kan örneklemesi. Yaklaşık 75.000 hCD34+ hücre farelere intravenöz olarak enjekte edilir ve insan kimerizmi düzeyi, ayrıca insanlaşma olarak da bilinir, periferik kanda akış sitometrisi tarafından aylarca uzunlamasına olarak tahmin edilmektedir. Toplam 75.000 hCD34+ hücre periferik kanda %20-50 insan CD45+ hücresi verir. Fareler HIV ile intravajinal enfeksiyona duyarlı dır ve kan analiz için haftada bir kez ve uzun süre ler için ayda iki kez örneklenebilir. Bu protokol, damlacık dijital PCR (ddPCR) kullanarak plazma viral yük nicelik için bir test açıklar. Farelerin diyette standart bir cART rejimi ile nasıl etkili bir şekilde tedavi edilebildiğini gösteriyoruz. Düzenli fare chow şeklinde cART teslim deneysel modelin önemli bir arıtma olduğunu. Bu model hem sistemik hem de topikal ön pozlama profilaksisi bileşiklerinin klinik öncesi analizinde ve yeni tedavilerin ve HIV kür stratejilerinin test edilmesinde kullanılabilir.

Introduction

İnsan immün yetmezlik virüsü (HIV) dünya çapında 37 milyondan fazla enfekte bireyler ile kronik bir enfeksiyondur1. Kombinasyon antiviral tedavi (cART) bir hayat kurtarıcı tedavi, ama bir çare hala garanti edilir. Böylece, HIV sürekli araştırma kolaylaştırmak için insan bağışıklık sistemi ve tepkileri ayna hayvan modelleri için bir ihtiyaç vardır. Hücre ve doku engraftment destekleme yeteneğine sahip insanlaşmış farelerin birden fazla türü ciddi immünoeksik fareler içine insan hücreleri nakli ile geliştirilmiştir2. Bu tür insanlaşmış fareler HIV enfeksiyonuna karşı hassastır ve insan olmayan primat simian immün yetmezlik virüs modellerine önemli bir alternatif sağlar, çünkü insan olmayan primatlardan daha ucuz ve kullanımı daha kolaydır. Humanized fareler HIV viral iletim araştırma kolaylaştırdı, patogenez, önleme, ve tedavi3,4,5,6,7,8,9,10,11.

Biz NOD fareler içine kordon kanı kaynaklı insan kök hücreleri nakli tarafından geliştirilen HIV araştırma için esnek bir insanlaştırılmış model sistemi saiyoruz. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Sug/JicTac (NOG) arka plan. Fetal kökenli olmamasının yanı sıra, bu farelerin pratik biyomühendislik daha az teknik olarak kan-karaciğer timus (BLT) yapı nakli dahil mikrocerrahi işlemler egöre talep edilir.

İntravajinal iletim yoluyla HIV enfeksiyonunun nasıl kurulabildiğini ve hassas bir damlacık dijital PCR (ddPCR) tabanlı kurulum la plazma viral yükünün nasıl izlendiğini gösteriyoruz. Daha sonra, günlük fare diyetinin bir parçası olarak verilen standart cART’ın kurulmasını tanımlıyoruz. Bu kombine yöntemlerin amacı hayvanlariçin stresi azaltmak ve her hayvan ın kullanımı nda harcanan sürenin sınırlı olduğu büyük ölçekli deneylerikolaylaştırmaktır 12.

İnsanlarda, bir CCR5Δ32/wt veya CCR5Δ32/ Δ32 genotip verici / kurucu virüsler13ile HIV enfeksiyonuna daha az duyarlılık neden olur , ve bazı önlemler zaman biyomühendislik insanlı fareler kök hücreleri ile HIV çalışmaları amacıyla alınması gerekir. CCR5 genidoğal olarak meydana gelen varyantları, özellikle Δ32 deletiyonları, dünyanın geri kalanına göre İskandinav ve Baltık yerli nüfuslarında daha yaygın olduğu için bu bölgemizde özellikle doğrudur14,15. Bu nedenle protokolümüz, transplantasyon öncesi CCR5 varyantları için donör hematopoetik kök hücrelerin taranması için kolay, yüksek iş akışı testini içermektedir.

İntravajinal maruziyet için biz verici seçti / kurucusu R5 virüsü RHPA4259, intravajinal enfekte oldu enfeksiyonun erken bir aşamasında bir kadından izole16. Fareleri, farelerin çoğunda başarılı bir iletim sağlamak için yeterli olan viral bir doza maruz bıraktık, ama %100 iletim hızının altındaydı. Böyle bir dozun seçilmesi, bir ilaç adayının antiviral etkilerinin HIV önleme deneylerinde korunan hayvanlara ve tedavi çalışmaları için viral yükün azalmasına yol açabileceği şekilde iletim hızında yeterli bir dinamik aralık sağlar.

Protocol

Tüm kordon kanı örnekleri, ebeveynler tarafından isimsiz bağışın bilgilendirilmiş onayı da dahil olmak üzere, yerel olarak onaylanmış protokollere uygun olarak kesin olarak elde edilebildi. Tüm hayvan deneyleri 2017-15-0201-01312 lisansı kapsamında Danimarka ulusal yönetmeliklerine uygun olarak onaylanarak gerçekleştirilmiştir. DİkKAT: HIV’e maruz kalan fareleri ve kanı son derece dikkatli kullanın. Hiv ile temas eden tüm yüzeyleri ve sıvıları doğrulanmış bir HIV…

Representative Results

Kök hücre saflık analizi için gating stratejisi Şekil 1’degösterilmiştir. Şekil 1A-C saflaştırılmış CD34+ popülasyonunu ve Şekil 1D-F CD34-akış-through’ı gösterir ve CD34+ popülasyonunun minimum miktarının izolasyon işleminde kaybolduğunu göstermektedir. İzole CD34+ kök hücrelerin saflığı -95 arasında ydı ve %1’den az T-hücre kontaminasyonu vardı. <strong class=…

Discussion

Ağır bağışıklık sistemi zayıflamış fare suş NOD. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Sug/JicTac (NOG) insan hücreleri ve dokuların nakli için son derece uygundur. Bu farelerde hem doğuştan gelen hem de adaptif bağışıklık yolları tehlikeye girer. NOG ve NSG fareleri, kusurlu T ve B hücre fonksiyonu ile sonuçlanan bir Prkdcscid mutasyonu barındırır. Ayrıca, bu fareler il-2, IL-4, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 ve IL-21 gibi birçok anahtar sitokinler…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar Aarhus Üniversitesi Biyotıp Hayvan Tesisi personeli, koloni bakım çabaları ve fare ağırlıkları izlemek için özellikle Bayan Jani Kær teşekkür etmek istiyorum. Yazarlar, standart bakım cART’ı geliştirdiği ve rehberlik için Profesör Florian Klein’a teşekkür etmek isterler. Aşağıdaki reaktif NIH AIDS Reaktif Programı, AIDS Bölümü, NIAID, NIH: pRHPA.c/2635 (kedi# 11744) Dr. John Kappes ve Dr. Christina Ochsenbauer tarafından elde edilmiştir.

Materials

Blue pad VWR 56616-031 Should be sterilized prior to use
Bovine serum albumin (BSA) Sigma A8022
CD19 (clone sj25c1) PE-Cy7 BD Bioscience 557835
CD3 (clone OKT3) FITC Biolegend 317306
CD3 (clone SK7) BUV395 BD Bioscience 564001
CD34 (clone AC136) FITC Miltenyi 130-113-740
CD4 (clone SK3) BUV 496 BD Bioscience 564652/51
CD45 (clone 2D1) APC Biolegend 368511/12
CD8 (clone RPA-T8) BV421 BD Bioscience 562428
ddPCR Supermix for probes (no dUTP) Bio-Rad 1863025
DMSO Merck 10,02,95,21,000
DNAse Sigma D4263 For suspension buffer
dNTP mix Life Technologies R0192
Dulbeccos phosphate-buffered saline (PBS) Biowest L0615-500
EasySep Human Cord Blood CD34 Positive Selection Kit II Stemcell 17896
EDTA Invitrogen 15575-038
FACS Lysing solution 10X BD 349202 Dilute 1:10 in dH20 immediately before use
FACS tubes (Falcon 5 mL round-botton) Falcon 352052
Fc Receptor blocking solution (Human Trustain FcX) Biolegend 422302
Fetal bovine serum Sigma F8192-500
Ficoll-Paque PLUS GE Healthcare 17144002
Flowjo v.10
Gauze Mesoft 157300 Should be sterilized prior to use
Heating lamp Custom made
Hemacytometer (Bürker-Türk) VWR DOWC1597418
Isoflurane gas Orion Pharma 9658
LSR Fortessa X20 flow cytometer BD
Microcentrifuge tubes, PCR-PT approved Sarstedt 72692405
Mouse cART food ssniff Spezialdiäten GmbH Custom made product
Mouse restrainer Custom made product
Needle, Microlance 3, 30G ½" BD 304000
NOG mice NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug/JicTac Taconic NOG-F
Nuclease-free water VWR chemicals 436912C
Nucleospin 96 Virus DNA and RNA isolation kit Macherey-Nagel 740691
PCR-approved microcentrifuge tubes Sarstedt 72.692.405
Penicillin-Streptomycin solution 100X Biowest L0022-100
Phusion Hot Start II DNA polymerase Life Technologies F549S
Pipette tips, sterile, ART 20P Barrier ThermoScientific 2149P
Proteinase K NEB 100005398
QuantaSoft software Bio-Rad
QX100 Droplet Generator Bio-Rad 1886-3008
QX100 Droplet Reader Bio-Rad 186-3003
RBC lysis solution Biolegend 420301
RNase-free DNAse size F + reaction buffer Macherey-Nagel 740963
RNAseOUT Recombinant Ribonuclease inhibitor ThermoScientific 10777-019
RPMI Biowest L0501-500 Dissolve in H20
Softject 1 mL syringe Henke Sass Wolf 5010-200V0
Superscript III Reverse Transcriptase ThermoFisher Scientific 18080044
Thermoshaker VWR 89370-910
Trypane blue Sigma T8154
Ultrapure 0.5 EDTA, pH 8.0 ThermoFisher Scientific 15575-020
Virkon S (virus disinfectant) Dupont 7511

References

  1. Skelton, J. K., Ortega-Prieto, A. M., Dorner, M. A Hitchhiker’s guide to humanized mice: new pathways to studying viral infections. Immunology. 154 (1), 50-61 (2018).
  2. Denton, P. W., Krisko, J. F., Powell, D. A., Mathias, M., Kwak, Y. T. Systemic Administration of Antiretrovirals Prior to Exposure Prevents Rectal and Intravenous HIV-1 Transmission in Humanized BLT Mice. PLoS ONE. 5 (1), 8829 (2010).
  3. Zou, W., et al. Nef functions in BLT mice to enhance HIV-1 replication and deplete CD4 + CD8 + thymocytes. Retrovirology. 9 (1), 44 (2012).
  4. Berges, B. K., Akkina, S. R., Folkvord, J. M., Connick, E., Akkina, R. Mucosal transmission of R5 and X4 tropic HIV-1 via vaginal and rectal routes in humanized Rag2 -/- γc -/- (RAG-hu) mice. Virology. 373 (2), 342-351 (2008).
  5. Veselinovic, M., Charlins, P., Akkina, R. Modeling HIV-1 Mucosal Transmission and Prevention in Humanized Mice. Methods Mol Biol. , 203-220 (2016).
  6. Neff, C. P., Kurisu, T., Ndolo, T., Fox, K., Akkina, R. A topical microbicide gel formulation of CCR5 antagonist maraviroc prevents HIV-1 vaginal transmission in humanized RAG-hu mice. PLoS ONE. 6 (6), 20209 (2011).
  7. Neff, P. C., Ndolo, T., Tandon, A., Habu, Y., Akkina, R. Oral pre-exposure prophylaxis by anti-retrovirals raltegravir and maraviroc protects against HIV-1 vaginal transmission in a humanized mouse model. PLoS ONE. 5 (12), 15257 (2010).
  8. Veselinovic, M., et al. HIV pre-exposure prophylaxis: Mucosal tissue drug distribution of RT inhibitor Tenofovir and entry inhibitor Maraviroc in a humanized mouse model. Virology. 464-465, 253-263 (2014).
  9. Akkina, R., et al. Humanized Rag1-/-γc-/- mice support multilineage hematopoiesis and are susceptible to HIV-1 infection via systemic and vaginal routes. PLoS ONE. 6 (6), 20169 (2011).
  10. Zhou, J., et al. Systemic administration of combinatorial dsiRNAs via nanoparticles efficiently suppresses HIV-1 infection in humanized mice. Molecular Therapy. 19 (12), 2228-2238 (2011).
  11. Balcombe, J. P., Barnard, N. D., Sandusky, C. Laboratory routines cause animal stress. Contemporary Topics in Laboratory Animal Science. 43 (6), 42-51 (2004).
  12. Trecarichi, E. M., et al. Partial protective effect of CCR5-Delta 32 heterozygosity in a cohort of heterosexual Italian HIV-1 exposed uninfected individuals. AIDS Research and Therapy. 3 (1), (2006).
  13. Novembre, J., Galvani, A. P., Slatkin, M. The geographic spread of the CCR5 Δ32 HIV-resistance allele. PLoS Biology. 3 (11), 1954-1962 (2005).
  14. Solloch, U. V., et al. Frequencies of gene variant CCR5-Δ32 in 87 countries based on next-generation sequencing of 1.3 million individuals sampled from 3 national DKMS donor centers. Human Immunology. 78 (11-12), 710-717 (2017).
  15. Ochsenbauer, C., et al. Generation of Transmitted/Founder HIV-1 Infectious Molecular Clones and Characterization of Their Replication Capacity in CD4 T Lymphocytes and Monocyte-Derived Macrophages. Journal of Virology. 86 (5), 2715-2728 (2012).
  16. Andersen, A. H. F., et al. Long-Acting, Potent Delivery of Combination Antiretroviral Therapy. ACS Macro Letters. 7 (5), 587-591 (2018).
  17. Caro, A. C., Hankenson, F. C., Marx, J. O. Comparison of thermoregulatory devices used during anesthesia of C57BL/6 mice and correlations between body temperature and physiologic parameters. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science JAALAS. 52 (5), 577-583 (2013).
  18. Gatlin, J., Padgett, A., Melkus, M. W., Kelly, P. F., Garcia, J. V. Long-term engraftment of nonobese diabetic/severe combined immunodeficient mice with human CD34+ cells transduced by a self-inactivating human immunodeficiency virus type 1 vector. Human Gene Therapy. 12 (9), 1079-1089 (2001).
  19. Leth, S., et al. HIV-1 transcriptional activity during frequent longitudinal sampling in aviremic patients on antiretroviral therapy. AIDS. 30 (5), 713-721 (2016).
  20. Halper-Stromberg, A., et al. Broadly neutralizing antibodies and viral inducers decrease rebound from HIV-1 latent reservoirs in humanized mice. Cell. 158 (5), 989-999 (2014).
  21. Rothenberger, M. K., et al. Large number of rebounding/founder HIV variants emerge from multifocal infection in lymphatic tissues after treatment interruption. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (10), 1126-1134 (2015).
  22. Rongvaux, A., et al. Human Hemato-Lymphoid System Mice: Current Use and Future Potential for Medicine. Annual Review of Immunology. 31 (1), 635-674 (2013).
  23. Walsh, N. C., et al. Humanized Mouse Models of Clinical Disease. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 12 (1), 187-215 (2017).
  24. Denton, P. W., García, J. V. Humanized mouse models of HIV infection. AIDS Reviews. 13 (3), 135-148 (2011).
  25. Denton, P. W., Søgaard, O. S., Tolstrup, M. Using animal models to overcome temporal, spatial and combinatorial challenges in HIV persistence research. Journal of Translational Medicine. 14 (1), (2016).
  26. Andersen, A. H. F., et al. cAIMP administration in humanized mice induces a chimerization-level-dependent STING response. Immunology. 157 (2), 163-172 (2019).
  27. Tanaka, S., et al. Development of Mature and Functional Human Myeloid Subsets in Hematopoietic Stem Cell-Engrafted NOD/SCID/IL2r KO Mice. The Journal of Immunology. 188 (12), 6145-6155 (2012).
  28. Quan, P. L., Sauzade, M., Brouzes, E. DPCR: A technology review. Sensors (Switzerland). 18 (4), (2018).
  29. Denton, P. W., et al. Generation of HIV Latency in Humanized BLT Mice. Journal of Virology. 86 (1), 630-634 (2012).
  30. Li, Y., et al. A human immune system mouse model with robust lymph node development. Nature Methods. 15 (8), 623-630 (2018).
  31. Satheesan, S., et al. HIV Replication and Latency in a Humanized NSG Mouse Model during Suppressive Oral Combinational Antiretroviral Therapy. Journal of Virology. 92 (7), 02118 (2018).
  32. Bachmanov, A. A., Reed, D. R., Beauchamp, G. K., Tordoff, M. G. Food intake, water intake, and drinking spout side preference of 28 mouse strains. Behavior Genetics. 32 (6), 435-443 (2002).
  33. Shultz, L. D., et al. Generation of functional human T-cell subsets with HLA-restricted immune responses in HLA class I expressing NOD/SCID/IL2r null humanized mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (29), 13022-13027 (2010).
  34. Willinger, T., et al. Human IL-3/GM-CSF knock-in mice support human alveolar macrophage development and human immune responses in the lung. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (6), 2390-2395 (2011).
  35. Hanazawa, A., et al. Generation of human immunosuppressive myeloid cell populations in human interleukin-6 transgenic NOG mice. Frontiers in Immunology. 9, (2018).
  36. Huntington, N. D., et al. IL-15 trans-presentation promotes human NK cell development and differentiation in vivo. The Journal of Experimental Medicine. 206 (1), 25-34 (2009).
  37. Rongvaux, A., et al. Development and function of human innate immune cells in a humanized mouse model. Nature Biotechnology. 32 (4), 364-372 (2014).

Play Video

Cite This Article
Andersen, A. H. F., Nielsen, S. S. F., Olesen, R., Mack, K., Dagnæs-Hansen, F., Uldbjerg, N., Østergaard, L., Søgaard, O. S., Denton, P. W., Tolstrup, M. Humanized NOG Mice for Intravaginal HIV Exposure and Treatment of HIV Infection. J. Vis. Exp. (155), e60723, doi:10.3791/60723 (2020).

View Video