Summary

Гуманизированные мыши NOG для интравагинального воздействия ВИЧ и лечения ВИЧ-инфекции

Published: January 31, 2020
doi:

Summary

Мы разработали протокол для генерации и оценки гуманизированной и человеческой иммунодефицита, зараженной вирусом NOG, мышиной модели на основе трансплантации стволовых клеток, внутривагинального воздействия вируса иммунодефицита человека и капель цифровой РНК ПЦР Количественная оценка.

Abstract

Гуманизированные мыши обеспечивают сложную платформу для изучения вирусологии вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) и тестирования противовирусных препаратов. Этот протокол описывает создание иммунной системы человека у взрослых мышей NOG. Здесь мы объясняем все практические шаги от изоляции пуповинной крови, полученных клетками CD34 человека и их последующей внутривенной трансплантации мышам, до манипуляции моделью через ВИЧ-инфекцию, комбинированной антиретровирусной терапии ( cART), и анализ крови. Приблизительно 75 000 hCD34 ‘клеток вводятся внутривенно в мышей и уровень человеческого химеризма, также известный как гуманизация, в периферической крови оценивается продольно в течение нескольких месяцев поток цитометрии. В общей сложности 75 000 клеток hCD34 дают 20%-50% клеток CD45 человека в периферической крови. Мыши восприимчивы к интравагинальной инфекции с ВИЧ и крови можно сделать один раз в неделю для анализа, и два раза в месяц в течение длительных периодов. Этот протокол описывает анализ для количественной оценки плазменной вирусной нагрузки с помощью капель цифрового ПЦР (ddPCR). Мы показываем, как мышей можно эффективно лечить с помощью стандартного режима cART в рационе. Доставка CART в виде обычного мышиного чау является значительной усовершенствованием экспериментальной модели. Эта модель может быть использована для доклинического анализа как системных, так и актуальных предэкспозиционных профилактических соединений, а также для тестирования новых методов лечения и стратегий лечения ВИЧ.

Introduction

Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) является хронической инфекцией с более чем 37 миллионов инфицированных людей во всем мире1. Комбинированная противовирусная терапия (cART) является спасительной терапией, но лечение по-прежнему оправдано. Таким образом, существует потребность в моделях животных, которые отражают иммунную систему человека и ее реакцию, с тем чтобы облегчить продолжение исследований в области ВИЧ. Несколько типов гуманизированных мышей, которые способны поддерживать клетки и ткани прививок были разработаны путем трансплантации человеческих клеток в сильно иммунодефицитных мышей2. Такие гуманизированные мыши подвержены ВИЧ-инфекции и являются важной альтернативой нечеловеческим моделям вирусов иммунодефицита приматов, поскольку они дешевле и проще в использовании, чем нечеловеческие приматы. Гуманизированные мыши способствовали исследованиям в области передачи вируса ВИЧ, патогенеза, профилактики и лечения3,4,5,6,8,9,10,11.

Мы представляем гибкую гуманизированную модельную систему исследований в области ВИЧ, разработанную путем пересадки пуповинной крови, полученных человеческими стволовыми клетками, мышам NOD. CG-PrkdcscidIl2rgtm1Sug/JicTac (NOG) фон. Помимо того, что нефетального происхождения, практическая биоинженерия этих мышей является менее технически требовательным по сравнению с микрохирургических процедур, участвующих в трансплантации крови печени-тимуса (BLT) построить.

Мы показываем, как установить ВИЧ-инфекцию с помощью интравагинальной передачи и как контролировать вирусную нагрузку плазмы с помощью чувствительной капли цифровой ПЦР (ddPCR) на основе установки. Впоследствии мы описываем создание стандартного CART, данного как часть ежедневной диеты мыши. Цель этих комбинированных методов заключается в снижении стресса для животных и содействовать крупномасштабным экспериментам, где время, затраченное на обработку каждого животного ограничено12.

У людей, CCR532 /WT или CCR5No32 / 32 генотип вызывает снижение восприимчивости к ВИЧ-инфекции с передатчиком / основателем вирусов13, и некоторые меры предосторожности должны быть приняты при биоинженерии гуманизированных мышей со стволовыми клетками для целей исследований ВИЧ. Это особенно верно в нашем регионе, потому что естественные варианты в гене CCR5, в частности, удаления 32 евро, более распространены в скандинавских и балтийских коренных народов по сравнению с остальным миром14,15. Таким образом, наш протокол включает в себя простой, высокопроизводительный анализ для скрининга донорских гематопоиетических стволовых клеток для вариантов CCR5 до трансплантации.

Для интравагинального воздействия мы выбрали передатчик / основатель R5 вирус RHPA4259, изолированные от женщины на ранней стадии инфекции, которая была инфицирована интравагинально16. Мы подвергли мышей вирусной дозе, которая была достаточна для успешной передачи у большинства мышей, но ниже 100% скорости передачи. Выбор такой дозы обеспечивает достаточный динамический диапазон в скорости передачи, что противовирусные эффекты кандидата на наркотики могут привести к защищенным животным в экспериментах по профилактике ВИЧ и снижению вирусной нагрузки для лечебных исследований.

Protocol

Все образцы пуповинной крови были получены в строгом соответствии с утвержденными на месте протоколами, включая информированное согласие родителей на анонимное донорство. Все эксперименты на животных были одобрены и проведены в строгом соответствии с датскими национальными правила?…

Representative Results

Стратегия анализа чистоты стволовых клеток изображена на рисунке 1. На рисунке 1A-C показана очищенная популяция CD34, а рисунок 1D-F CD34- поток, используемый для иллюстрации того, что минимальное количество популяции CD34 теряе…

Discussion

Сильно иммунокомпромиссный штамм мыши NOD. CG-PrkdcscidIl2rgtm1Sug/JicTac (NOG) очень хорошо подходит для трансплантации человеческих клеток и тканей. Как врожденные, так и адаптивные иммунные пути у этих мышей скомпрометированы. NoG и NSG мышей гавани Prkdcнаучной мутац?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы хотели бы поблагодарить сотрудников Фонда биомедицины животных Орхусского университета, в частности г-жу Джани Кер за усилия по содержанию колоний и за отслеживание веса мышей. Авторы хотели бы поблагодарить профессора Флориана Кляйна за разработку стандарта медицинской помощи и за руководство. Следующий реагент был получен в рамках программы NIH AIDS Reagent, Отдел по СПИДу, NIAID, NIH: pRHPA.c/2635 (кошка 11744) от д-ра Джона Каппеса и д-ра Кристины Охсенбауэр.

Materials

Blue pad VWR 56616-031 Should be sterilized prior to use
Bovine serum albumin (BSA) Sigma A8022
CD19 (clone sj25c1) PE-Cy7 BD Bioscience 557835
CD3 (clone OKT3) FITC Biolegend 317306
CD3 (clone SK7) BUV395 BD Bioscience 564001
CD34 (clone AC136) FITC Miltenyi 130-113-740
CD4 (clone SK3) BUV 496 BD Bioscience 564652/51
CD45 (clone 2D1) APC Biolegend 368511/12
CD8 (clone RPA-T8) BV421 BD Bioscience 562428
ddPCR Supermix for probes (no dUTP) Bio-Rad 1863025
DMSO Merck 10,02,95,21,000
DNAse Sigma D4263 For suspension buffer
dNTP mix Life Technologies R0192
Dulbeccos phosphate-buffered saline (PBS) Biowest L0615-500
EasySep Human Cord Blood CD34 Positive Selection Kit II Stemcell 17896
EDTA Invitrogen 15575-038
FACS Lysing solution 10X BD 349202 Dilute 1:10 in dH20 immediately before use
FACS tubes (Falcon 5 mL round-botton) Falcon 352052
Fc Receptor blocking solution (Human Trustain FcX) Biolegend 422302
Fetal bovine serum Sigma F8192-500
Ficoll-Paque PLUS GE Healthcare 17144002
Flowjo v.10
Gauze Mesoft 157300 Should be sterilized prior to use
Heating lamp Custom made
Hemacytometer (Bürker-Türk) VWR DOWC1597418
Isoflurane gas Orion Pharma 9658
LSR Fortessa X20 flow cytometer BD
Microcentrifuge tubes, PCR-PT approved Sarstedt 72692405
Mouse cART food ssniff Spezialdiäten GmbH Custom made product
Mouse restrainer Custom made product
Needle, Microlance 3, 30G ½" BD 304000
NOG mice NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug/JicTac Taconic NOG-F
Nuclease-free water VWR chemicals 436912C
Nucleospin 96 Virus DNA and RNA isolation kit Macherey-Nagel 740691
PCR-approved microcentrifuge tubes Sarstedt 72.692.405
Penicillin-Streptomycin solution 100X Biowest L0022-100
Phusion Hot Start II DNA polymerase Life Technologies F549S
Pipette tips, sterile, ART 20P Barrier ThermoScientific 2149P
Proteinase K NEB 100005398
QuantaSoft software Bio-Rad
QX100 Droplet Generator Bio-Rad 1886-3008
QX100 Droplet Reader Bio-Rad 186-3003
RBC lysis solution Biolegend 420301
RNase-free DNAse size F + reaction buffer Macherey-Nagel 740963
RNAseOUT Recombinant Ribonuclease inhibitor ThermoScientific 10777-019
RPMI Biowest L0501-500 Dissolve in H20
Softject 1 mL syringe Henke Sass Wolf 5010-200V0
Superscript III Reverse Transcriptase ThermoFisher Scientific 18080044
Thermoshaker VWR 89370-910
Trypane blue Sigma T8154
Ultrapure 0.5 EDTA, pH 8.0 ThermoFisher Scientific 15575-020
Virkon S (virus disinfectant) Dupont 7511

References

  1. Skelton, J. K., Ortega-Prieto, A. M., Dorner, M. A Hitchhiker’s guide to humanized mice: new pathways to studying viral infections. Immunology. 154 (1), 50-61 (2018).
  2. Denton, P. W., Krisko, J. F., Powell, D. A., Mathias, M., Kwak, Y. T. Systemic Administration of Antiretrovirals Prior to Exposure Prevents Rectal and Intravenous HIV-1 Transmission in Humanized BLT Mice. PLoS ONE. 5 (1), 8829 (2010).
  3. Zou, W., et al. Nef functions in BLT mice to enhance HIV-1 replication and deplete CD4 + CD8 + thymocytes. Retrovirology. 9 (1), 44 (2012).
  4. Berges, B. K., Akkina, S. R., Folkvord, J. M., Connick, E., Akkina, R. Mucosal transmission of R5 and X4 tropic HIV-1 via vaginal and rectal routes in humanized Rag2 -/- γc -/- (RAG-hu) mice. Virology. 373 (2), 342-351 (2008).
  5. Veselinovic, M., Charlins, P., Akkina, R. Modeling HIV-1 Mucosal Transmission and Prevention in Humanized Mice. Methods Mol Biol. , 203-220 (2016).
  6. Neff, C. P., Kurisu, T., Ndolo, T., Fox, K., Akkina, R. A topical microbicide gel formulation of CCR5 antagonist maraviroc prevents HIV-1 vaginal transmission in humanized RAG-hu mice. PLoS ONE. 6 (6), 20209 (2011).
  7. Neff, P. C., Ndolo, T., Tandon, A., Habu, Y., Akkina, R. Oral pre-exposure prophylaxis by anti-retrovirals raltegravir and maraviroc protects against HIV-1 vaginal transmission in a humanized mouse model. PLoS ONE. 5 (12), 15257 (2010).
  8. Veselinovic, M., et al. HIV pre-exposure prophylaxis: Mucosal tissue drug distribution of RT inhibitor Tenofovir and entry inhibitor Maraviroc in a humanized mouse model. Virology. 464-465, 253-263 (2014).
  9. Akkina, R., et al. Humanized Rag1-/-γc-/- mice support multilineage hematopoiesis and are susceptible to HIV-1 infection via systemic and vaginal routes. PLoS ONE. 6 (6), 20169 (2011).
  10. Zhou, J., et al. Systemic administration of combinatorial dsiRNAs via nanoparticles efficiently suppresses HIV-1 infection in humanized mice. Molecular Therapy. 19 (12), 2228-2238 (2011).
  11. Balcombe, J. P., Barnard, N. D., Sandusky, C. Laboratory routines cause animal stress. Contemporary Topics in Laboratory Animal Science. 43 (6), 42-51 (2004).
  12. Trecarichi, E. M., et al. Partial protective effect of CCR5-Delta 32 heterozygosity in a cohort of heterosexual Italian HIV-1 exposed uninfected individuals. AIDS Research and Therapy. 3 (1), (2006).
  13. Novembre, J., Galvani, A. P., Slatkin, M. The geographic spread of the CCR5 Δ32 HIV-resistance allele. PLoS Biology. 3 (11), 1954-1962 (2005).
  14. Solloch, U. V., et al. Frequencies of gene variant CCR5-Δ32 in 87 countries based on next-generation sequencing of 1.3 million individuals sampled from 3 national DKMS donor centers. Human Immunology. 78 (11-12), 710-717 (2017).
  15. Ochsenbauer, C., et al. Generation of Transmitted/Founder HIV-1 Infectious Molecular Clones and Characterization of Their Replication Capacity in CD4 T Lymphocytes and Monocyte-Derived Macrophages. Journal of Virology. 86 (5), 2715-2728 (2012).
  16. Andersen, A. H. F., et al. Long-Acting, Potent Delivery of Combination Antiretroviral Therapy. ACS Macro Letters. 7 (5), 587-591 (2018).
  17. Caro, A. C., Hankenson, F. C., Marx, J. O. Comparison of thermoregulatory devices used during anesthesia of C57BL/6 mice and correlations between body temperature and physiologic parameters. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science JAALAS. 52 (5), 577-583 (2013).
  18. Gatlin, J., Padgett, A., Melkus, M. W., Kelly, P. F., Garcia, J. V. Long-term engraftment of nonobese diabetic/severe combined immunodeficient mice with human CD34+ cells transduced by a self-inactivating human immunodeficiency virus type 1 vector. Human Gene Therapy. 12 (9), 1079-1089 (2001).
  19. Leth, S., et al. HIV-1 transcriptional activity during frequent longitudinal sampling in aviremic patients on antiretroviral therapy. AIDS. 30 (5), 713-721 (2016).
  20. Halper-Stromberg, A., et al. Broadly neutralizing antibodies and viral inducers decrease rebound from HIV-1 latent reservoirs in humanized mice. Cell. 158 (5), 989-999 (2014).
  21. Rothenberger, M. K., et al. Large number of rebounding/founder HIV variants emerge from multifocal infection in lymphatic tissues after treatment interruption. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (10), 1126-1134 (2015).
  22. Rongvaux, A., et al. Human Hemato-Lymphoid System Mice: Current Use and Future Potential for Medicine. Annual Review of Immunology. 31 (1), 635-674 (2013).
  23. Walsh, N. C., et al. Humanized Mouse Models of Clinical Disease. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 12 (1), 187-215 (2017).
  24. Denton, P. W., García, J. V. Humanized mouse models of HIV infection. AIDS Reviews. 13 (3), 135-148 (2011).
  25. Denton, P. W., Søgaard, O. S., Tolstrup, M. Using animal models to overcome temporal, spatial and combinatorial challenges in HIV persistence research. Journal of Translational Medicine. 14 (1), (2016).
  26. Andersen, A. H. F., et al. cAIMP administration in humanized mice induces a chimerization-level-dependent STING response. Immunology. 157 (2), 163-172 (2019).
  27. Tanaka, S., et al. Development of Mature and Functional Human Myeloid Subsets in Hematopoietic Stem Cell-Engrafted NOD/SCID/IL2r KO Mice. The Journal of Immunology. 188 (12), 6145-6155 (2012).
  28. Quan, P. L., Sauzade, M., Brouzes, E. DPCR: A technology review. Sensors (Switzerland). 18 (4), (2018).
  29. Denton, P. W., et al. Generation of HIV Latency in Humanized BLT Mice. Journal of Virology. 86 (1), 630-634 (2012).
  30. Li, Y., et al. A human immune system mouse model with robust lymph node development. Nature Methods. 15 (8), 623-630 (2018).
  31. Satheesan, S., et al. HIV Replication and Latency in a Humanized NSG Mouse Model during Suppressive Oral Combinational Antiretroviral Therapy. Journal of Virology. 92 (7), 02118 (2018).
  32. Bachmanov, A. A., Reed, D. R., Beauchamp, G. K., Tordoff, M. G. Food intake, water intake, and drinking spout side preference of 28 mouse strains. Behavior Genetics. 32 (6), 435-443 (2002).
  33. Shultz, L. D., et al. Generation of functional human T-cell subsets with HLA-restricted immune responses in HLA class I expressing NOD/SCID/IL2r null humanized mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (29), 13022-13027 (2010).
  34. Willinger, T., et al. Human IL-3/GM-CSF knock-in mice support human alveolar macrophage development and human immune responses in the lung. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (6), 2390-2395 (2011).
  35. Hanazawa, A., et al. Generation of human immunosuppressive myeloid cell populations in human interleukin-6 transgenic NOG mice. Frontiers in Immunology. 9, (2018).
  36. Huntington, N. D., et al. IL-15 trans-presentation promotes human NK cell development and differentiation in vivo. The Journal of Experimental Medicine. 206 (1), 25-34 (2009).
  37. Rongvaux, A., et al. Development and function of human innate immune cells in a humanized mouse model. Nature Biotechnology. 32 (4), 364-372 (2014).

Play Video

Cite This Article
Andersen, A. H. F., Nielsen, S. S. F., Olesen, R., Mack, K., Dagnæs-Hansen, F., Uldbjerg, N., Østergaard, L., Søgaard, O. S., Denton, P. W., Tolstrup, M. Humanized NOG Mice for Intravaginal HIV Exposure and Treatment of HIV Infection. J. Vis. Exp. (155), e60723, doi:10.3791/60723 (2020).

View Video