Summary

Gehumaniseerde NOG Muizen voor intravaginale HIV Blootstelling en behandeling van HIV-infectie

Published: January 31, 2020
doi:

Summary

We hebben een protocol ontwikkeld voor de generatie en evaluatie van een gehumaniseerd en menselijk immunodeficiëntievirus besmet NOG muismodel op basis van stamceltransplantatie, intravaginale blootstelling aan het menselijke immunodeficiëntievirus en druppeldigitale PCR RNA Kwantificering.

Abstract

Gehumaniseerde muizen bieden een geavanceerd platform om menselijke immunodeficiëntievirus (HIV) virologie te bestuderen en antivirale geneesmiddelen te testen. Dit protocol beschrijft de oprichting van een menselijk immuunsysteem bij volwassen NOG muizen. Hier leggen we alle praktische stappen uit van isolatie van navelstrengbloed afkomstig van menselijke CD34+ cellen en hun daaropvolgende intraveneuze transplantatie in de muizen, tot de manipulatie van het model door hiv-infectie, combinatie antiretrovirale therapie ( cART) en bloedafname. Ongeveer 75.000 hCD34+ cellen worden intraveneus geïnjecteerd in de muizen en het niveau van menselijk chimerisme, ook bekend als humanisering, in het perifere bloed wordt in de lengterichting geschat voor maanden door flow cytometrie. Een totaal van 75.000 hCD34+ cellen levert 20%–50% menselijke CD45+ cellen op in het perifere bloed. De muizen zijn gevoelig voor intravaginale infectie met HIV en bloed kan eenmaal per week worden bemonsterd voor analyse, en twee maal per maand voor langere perioden. Dit protocol beschrijft een test voor kwantificering van plasma virale belasting met behulp van druppel digitale PCR (ddPCR). We laten zien hoe de muizen effectief kunnen worden behandeld met een standaard-of-care cART-regime in het dieet. De levering van cART in de vorm van gewone muis chow is een aanzienlijke verfijning van het experimentele model. Dit model kan worden gebruikt voor preklinische analyse van zowel systemische als actuele pre-exposure profylaxeverbindingen en voor het testen van nieuwe behandelingen en HIV-genezingsstrategieën.

Introduction

Menselijk immunodeficiëntievirus (HIV) is een chronische infectie met meer dan 37 miljoen geïnfecteerde personen wereldwijd1. Combinatie antivirale therapie (cART) is een levensreddende therapie, maar een remedie is nog steeds gerechtvaardigd. Er is dus behoefte aan diermodellen die het menselijk immuunsysteem en de reacties ervan weerspiegelen om verder onderzoek naar HIV te vergemakkelijken. Meerdere soorten gehumaniseerde muizen die cel- en weefselengraftment kunnen ondersteunen, zijn ontwikkeld door menselijke cellen te transplanteren in ernstig immunodeficiënte muizen2. Dergelijke gehumaniseerde muizen zijn gevoelig voor HIV-infectie en bieden een belangrijk alternatief voor niet-menselijke primaat simian immunodeficiëntie virus modellen, omdat ze goedkoper en eenvoudiger te gebruiken dan niet-menselijke primaten. Gehumaniseerde muizen hebben onderzoek naar hiv-virale overdracht, pathogenese, preventie en behandeling3,4,5,6,7,8,9,10,11vergemakkelijkt.

We presenteren een flexibel gehumaniseerd modelsysteem voor HIV-onderzoek ontwikkeld door het transplanteren van navelstrengbloed afkomstige menselijke stamcellen in muizen van de NOD. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Sug/ JicTac (NOG) achtergrond. Naast het feit dat van niet-foetale oorsprong, de praktische bio-engineering van deze muizen is minder technisch veeleisend in vergelijking met de microchirurgische procedures die betrokken zijn bij de transplantatie van de bloed-lever-thymus (BLT) constructie.

We laten zien hoe je hiv-infectie vast te stellen door middel van intravaginale transmissie en hoe het plasma virale belasting te controleren met een gevoelige druppel digitale PCR (ddPCR) gebaseerde setup. Vervolgens beschrijven we de oprichting van standaard cART gegeven als onderdeel van de dagelijkse muis dieet. Het doel van deze gecombineerde methoden is om stress voor de dieren te verminderen en grootschalige experimenten te vergemakkelijken waarbij de tijd die wordt besteed aan het hanteren van elk dier beperkt is12.

Bij mensen veroorzaakt een CCR5Δ32/wt of CCR5Δ32/ Δ32 genotype een verminderde gevoeligheid voor hiv-infectie met zender/stichtersvirussen13, en sommige voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen bij bio-engineering gehumaniseerde muizen met stamcellen voor hiv-studies. Dit geldt vooral in onze regio omdat natuurlijk voorkomende varianten in het CCR5-gen, met name Δ32-deleties, vaker voorkomen in Scandinavische en Baltische inheemse populaties in vergelijking met de rest van de wereld14,15. Zo bevat ons protocol een eenvoudige, hoge doorvoertest voor het screenen van donorhematopoietische stamcellen voor CCR5-varianten voorafgaand aan transplantatie.

Voor de intravaginale blootstelling kozen we de zender / oprichter R5 virus RHPA4259, geïsoleerd van een vrouw in een vroeg stadium van infectie die intravaginale besmet was16. We stelden de muizen bloot aan een virale dosis die voldoende was om een succesvolle overdracht in de meerderheid van de muizen op te leveren, maar onder een 100% transmissiesnelheid. Het kiezen van een dergelijke dosis maakt een voldoende dynamisch bereik in transmissiesnelheid mogelijk, zodat antivirale effecten van een kandidaat-geneesmiddel kunnen leiden tot beschermde dieren in hiv-preventie-experimenten en verminderde virale belasting voor behandelingsstudies.

Protocol

Alle navelstrengbloedmonsters werden verkregen in strikte overeenstemming met lokaal goedgekeurde protocollen, waaronder geïnformeerde toestemming van anonieme donatie door de ouders. Alle dierproeven werden goedgekeurd en uitgevoerd in strikte overeenstemming met de Deense nationale regelgeving in het kader van de licentie 2017-15-0201-01312. LET OP: Omgaan met hiv blootgestelde muizen en bloed met uiterste voorzichtigheid. Ontsmetten alle oppervlakken en vloeistoffen die in contact zijn gew…

Representative Results

De gatingstrategie voor de analyse van de zuiverheid van stamcellen is afgebeeld in figuur 1. Figuur 1A-C toont de gezuiverde CD34+ populatie en figuur 1D-F de CD34-flow-through die wordt gebruikt om te illustreren dat de minimale hoeveelheid cd34+ populatie verloren gaat in het isolatieproces. De zuiverheid van geïsoleerde CD34+ stamcellen lag tussen 85%-95% met minder dan 1% T-celverontreiniging….

Discussion

De ernstig immuungecompromitteerde muisstam NOD. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Sug/JicTac (NOG) is uitermate geschikt voor transplantatie van menselijke cellen en weefsels. Zowel aangeboren als adaptieve immuuntrajecten bij deze muizen zijn gecompromitteerd. NOG- en NSG-muizen herbergen een Prkdcscid mutatie die resulteert in een defecte T- en B-celfunctie. Bovendien missen deze muizen een functionele interleukine-2 receptor γ-keten (gemeenschappelijke gammakete…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De auteurs willen de medewerkers van de Biomedicine Animal Facility van de Universiteit van Aarhus, in het bijzonder mevrouw Jani Kær, bedanken voor de inspanningen van de kolonieen en voor het bijhouden van muisgewichten. De auteurs willen professor Florian Klein bedanken voor de ontwikkeling van standaard-of-care cART en voor begeleiding. De volgende reagens werd verkregen via de NIH AIDS Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH: pRHPA.c/2635 (cat# 11744) van Dr. John Kappes en Dr Christina Ochsenbauer.

Materials

Blue pad VWR 56616-031 Should be sterilized prior to use
Bovine serum albumin (BSA) Sigma A8022
CD19 (clone sj25c1) PE-Cy7 BD Bioscience 557835
CD3 (clone OKT3) FITC Biolegend 317306
CD3 (clone SK7) BUV395 BD Bioscience 564001
CD34 (clone AC136) FITC Miltenyi 130-113-740
CD4 (clone SK3) BUV 496 BD Bioscience 564652/51
CD45 (clone 2D1) APC Biolegend 368511/12
CD8 (clone RPA-T8) BV421 BD Bioscience 562428
ddPCR Supermix for probes (no dUTP) Bio-Rad 1863025
DMSO Merck 10,02,95,21,000
DNAse Sigma D4263 For suspension buffer
dNTP mix Life Technologies R0192
Dulbeccos phosphate-buffered saline (PBS) Biowest L0615-500
EasySep Human Cord Blood CD34 Positive Selection Kit II Stemcell 17896
EDTA Invitrogen 15575-038
FACS Lysing solution 10X BD 349202 Dilute 1:10 in dH20 immediately before use
FACS tubes (Falcon 5 mL round-botton) Falcon 352052
Fc Receptor blocking solution (Human Trustain FcX) Biolegend 422302
Fetal bovine serum Sigma F8192-500
Ficoll-Paque PLUS GE Healthcare 17144002
Flowjo v.10
Gauze Mesoft 157300 Should be sterilized prior to use
Heating lamp Custom made
Hemacytometer (Bürker-Türk) VWR DOWC1597418
Isoflurane gas Orion Pharma 9658
LSR Fortessa X20 flow cytometer BD
Microcentrifuge tubes, PCR-PT approved Sarstedt 72692405
Mouse cART food ssniff Spezialdiäten GmbH Custom made product
Mouse restrainer Custom made product
Needle, Microlance 3, 30G ½" BD 304000
NOG mice NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug/JicTac Taconic NOG-F
Nuclease-free water VWR chemicals 436912C
Nucleospin 96 Virus DNA and RNA isolation kit Macherey-Nagel 740691
PCR-approved microcentrifuge tubes Sarstedt 72.692.405
Penicillin-Streptomycin solution 100X Biowest L0022-100
Phusion Hot Start II DNA polymerase Life Technologies F549S
Pipette tips, sterile, ART 20P Barrier ThermoScientific 2149P
Proteinase K NEB 100005398
QuantaSoft software Bio-Rad
QX100 Droplet Generator Bio-Rad 1886-3008
QX100 Droplet Reader Bio-Rad 186-3003
RBC lysis solution Biolegend 420301
RNase-free DNAse size F + reaction buffer Macherey-Nagel 740963
RNAseOUT Recombinant Ribonuclease inhibitor ThermoScientific 10777-019
RPMI Biowest L0501-500 Dissolve in H20
Softject 1 mL syringe Henke Sass Wolf 5010-200V0
Superscript III Reverse Transcriptase ThermoFisher Scientific 18080044
Thermoshaker VWR 89370-910
Trypane blue Sigma T8154
Ultrapure 0.5 EDTA, pH 8.0 ThermoFisher Scientific 15575-020
Virkon S (virus disinfectant) Dupont 7511

References

  1. Skelton, J. K., Ortega-Prieto, A. M., Dorner, M. A Hitchhiker’s guide to humanized mice: new pathways to studying viral infections. Immunology. 154 (1), 50-61 (2018).
  2. Denton, P. W., Krisko, J. F., Powell, D. A., Mathias, M., Kwak, Y. T. Systemic Administration of Antiretrovirals Prior to Exposure Prevents Rectal and Intravenous HIV-1 Transmission in Humanized BLT Mice. PLoS ONE. 5 (1), 8829 (2010).
  3. Zou, W., et al. Nef functions in BLT mice to enhance HIV-1 replication and deplete CD4 + CD8 + thymocytes. Retrovirology. 9 (1), 44 (2012).
  4. Berges, B. K., Akkina, S. R., Folkvord, J. M., Connick, E., Akkina, R. Mucosal transmission of R5 and X4 tropic HIV-1 via vaginal and rectal routes in humanized Rag2 -/- γc -/- (RAG-hu) mice. Virology. 373 (2), 342-351 (2008).
  5. Veselinovic, M., Charlins, P., Akkina, R. Modeling HIV-1 Mucosal Transmission and Prevention in Humanized Mice. Methods Mol Biol. , 203-220 (2016).
  6. Neff, C. P., Kurisu, T., Ndolo, T., Fox, K., Akkina, R. A topical microbicide gel formulation of CCR5 antagonist maraviroc prevents HIV-1 vaginal transmission in humanized RAG-hu mice. PLoS ONE. 6 (6), 20209 (2011).
  7. Neff, P. C., Ndolo, T., Tandon, A., Habu, Y., Akkina, R. Oral pre-exposure prophylaxis by anti-retrovirals raltegravir and maraviroc protects against HIV-1 vaginal transmission in a humanized mouse model. PLoS ONE. 5 (12), 15257 (2010).
  8. Veselinovic, M., et al. HIV pre-exposure prophylaxis: Mucosal tissue drug distribution of RT inhibitor Tenofovir and entry inhibitor Maraviroc in a humanized mouse model. Virology. 464-465, 253-263 (2014).
  9. Akkina, R., et al. Humanized Rag1-/-γc-/- mice support multilineage hematopoiesis and are susceptible to HIV-1 infection via systemic and vaginal routes. PLoS ONE. 6 (6), 20169 (2011).
  10. Zhou, J., et al. Systemic administration of combinatorial dsiRNAs via nanoparticles efficiently suppresses HIV-1 infection in humanized mice. Molecular Therapy. 19 (12), 2228-2238 (2011).
  11. Balcombe, J. P., Barnard, N. D., Sandusky, C. Laboratory routines cause animal stress. Contemporary Topics in Laboratory Animal Science. 43 (6), 42-51 (2004).
  12. Trecarichi, E. M., et al. Partial protective effect of CCR5-Delta 32 heterozygosity in a cohort of heterosexual Italian HIV-1 exposed uninfected individuals. AIDS Research and Therapy. 3 (1), (2006).
  13. Novembre, J., Galvani, A. P., Slatkin, M. The geographic spread of the CCR5 Δ32 HIV-resistance allele. PLoS Biology. 3 (11), 1954-1962 (2005).
  14. Solloch, U. V., et al. Frequencies of gene variant CCR5-Δ32 in 87 countries based on next-generation sequencing of 1.3 million individuals sampled from 3 national DKMS donor centers. Human Immunology. 78 (11-12), 710-717 (2017).
  15. Ochsenbauer, C., et al. Generation of Transmitted/Founder HIV-1 Infectious Molecular Clones and Characterization of Their Replication Capacity in CD4 T Lymphocytes and Monocyte-Derived Macrophages. Journal of Virology. 86 (5), 2715-2728 (2012).
  16. Andersen, A. H. F., et al. Long-Acting, Potent Delivery of Combination Antiretroviral Therapy. ACS Macro Letters. 7 (5), 587-591 (2018).
  17. Caro, A. C., Hankenson, F. C., Marx, J. O. Comparison of thermoregulatory devices used during anesthesia of C57BL/6 mice and correlations between body temperature and physiologic parameters. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science JAALAS. 52 (5), 577-583 (2013).
  18. Gatlin, J., Padgett, A., Melkus, M. W., Kelly, P. F., Garcia, J. V. Long-term engraftment of nonobese diabetic/severe combined immunodeficient mice with human CD34+ cells transduced by a self-inactivating human immunodeficiency virus type 1 vector. Human Gene Therapy. 12 (9), 1079-1089 (2001).
  19. Leth, S., et al. HIV-1 transcriptional activity during frequent longitudinal sampling in aviremic patients on antiretroviral therapy. AIDS. 30 (5), 713-721 (2016).
  20. Halper-Stromberg, A., et al. Broadly neutralizing antibodies and viral inducers decrease rebound from HIV-1 latent reservoirs in humanized mice. Cell. 158 (5), 989-999 (2014).
  21. Rothenberger, M. K., et al. Large number of rebounding/founder HIV variants emerge from multifocal infection in lymphatic tissues after treatment interruption. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (10), 1126-1134 (2015).
  22. Rongvaux, A., et al. Human Hemato-Lymphoid System Mice: Current Use and Future Potential for Medicine. Annual Review of Immunology. 31 (1), 635-674 (2013).
  23. Walsh, N. C., et al. Humanized Mouse Models of Clinical Disease. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 12 (1), 187-215 (2017).
  24. Denton, P. W., García, J. V. Humanized mouse models of HIV infection. AIDS Reviews. 13 (3), 135-148 (2011).
  25. Denton, P. W., Søgaard, O. S., Tolstrup, M. Using animal models to overcome temporal, spatial and combinatorial challenges in HIV persistence research. Journal of Translational Medicine. 14 (1), (2016).
  26. Andersen, A. H. F., et al. cAIMP administration in humanized mice induces a chimerization-level-dependent STING response. Immunology. 157 (2), 163-172 (2019).
  27. Tanaka, S., et al. Development of Mature and Functional Human Myeloid Subsets in Hematopoietic Stem Cell-Engrafted NOD/SCID/IL2r KO Mice. The Journal of Immunology. 188 (12), 6145-6155 (2012).
  28. Quan, P. L., Sauzade, M., Brouzes, E. DPCR: A technology review. Sensors (Switzerland). 18 (4), (2018).
  29. Denton, P. W., et al. Generation of HIV Latency in Humanized BLT Mice. Journal of Virology. 86 (1), 630-634 (2012).
  30. Li, Y., et al. A human immune system mouse model with robust lymph node development. Nature Methods. 15 (8), 623-630 (2018).
  31. Satheesan, S., et al. HIV Replication and Latency in a Humanized NSG Mouse Model during Suppressive Oral Combinational Antiretroviral Therapy. Journal of Virology. 92 (7), 02118 (2018).
  32. Bachmanov, A. A., Reed, D. R., Beauchamp, G. K., Tordoff, M. G. Food intake, water intake, and drinking spout side preference of 28 mouse strains. Behavior Genetics. 32 (6), 435-443 (2002).
  33. Shultz, L. D., et al. Generation of functional human T-cell subsets with HLA-restricted immune responses in HLA class I expressing NOD/SCID/IL2r null humanized mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (29), 13022-13027 (2010).
  34. Willinger, T., et al. Human IL-3/GM-CSF knock-in mice support human alveolar macrophage development and human immune responses in the lung. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (6), 2390-2395 (2011).
  35. Hanazawa, A., et al. Generation of human immunosuppressive myeloid cell populations in human interleukin-6 transgenic NOG mice. Frontiers in Immunology. 9, (2018).
  36. Huntington, N. D., et al. IL-15 trans-presentation promotes human NK cell development and differentiation in vivo. The Journal of Experimental Medicine. 206 (1), 25-34 (2009).
  37. Rongvaux, A., et al. Development and function of human innate immune cells in a humanized mouse model. Nature Biotechnology. 32 (4), 364-372 (2014).

Play Video

Cite This Article
Andersen, A. H. F., Nielsen, S. S. F., Olesen, R., Mack, K., Dagnæs-Hansen, F., Uldbjerg, N., Østergaard, L., Søgaard, O. S., Denton, P. W., Tolstrup, M. Humanized NOG Mice for Intravaginal HIV Exposure and Treatment of HIV Infection. J. Vis. Exp. (155), e60723, doi:10.3791/60723 (2020).

View Video