Summary

Souris NOG humanisées pour l'exposition intravaginale au VIH et le traitement de l'infection par le VIH

Published: January 31, 2020
doi:

Summary

Nous avons développé un protocole pour la génération et l’évaluation d’un modèle de souris NOG humanisé et infecté par le virus de l’immunodéficience humaine basé sur la greffe de cellules souches, l’exposition intravaginale au virus de l’immunodéficience humaine et l’ARN PCR numérique de gouttelettes Quantification.

Abstract

Les souris humanisées fournissent une plate-forme sophistiquée pour étudier la virologie du virus de l’immunodéficience humaine (VIH) et pour tester les médicaments antiviraux. Ce protocole décrit l’établissement d’un système immunitaire humain chez les souris adultes NOG. Ici, nous expliquons toutes les étapes pratiques de l’isolement des cellules CD34 de Sang de cordon ombilical dérivées de CD34 Et de leur transplantation intraveineuse subséquente chez les souris, à la manipulation du modèle par l’infection par le VIH, thérapie antirétrovirale combinée ( cART), et l’échantillonnage de sang. Environ 75 000 cellules hCD34 sont injectées par voie intraveineuse chez les souris et le niveau de chimérisme humain, également connu sous le nom d’humanisation, dans le sang périphérique est estimé longitudinalement pendant des mois par cytométrie de flux. Au total, 75 000 cellules hCD34MD génèrent des cellules CD45 MD humaines de 20 % à 50 % dans le sang périphérique. Les souris sont sensibles à l’infection intravaginale par le VIH et le sang peut être échantillonné une fois par semaine pour l’analyse, et deux fois par mois pendant de longues périodes. Ce protocole décrit un analyse pour la quantification de la charge virale plasmatique à l’aide de gouttelettes PCR numérique (ddPCR). Nous montrons comment les souris peuvent être traitées efficacement avec un régime standard de soins de cART dans l’alimentation. La livraison de cART sous la forme de chow souris régulière est un raffinement significatif du modèle expérimental. Ce modèle peut être utilisé pour l’analyse préclinique des composés de prophylaxie pré-exposition systémiques et topiques ainsi que pour le dépistage de nouveaux traitements et stratégies de guérison du VIH.

Introduction

Le virus de l’immunodéficience humaine (VIH) est une infection chronique avec plus de 37 millions de personnes infectées dans le monde1. La thérapie antivirale combinée (cART) est un traitement salvateur, mais un traitement est toujours justifié. Il est donc nécessaire d’avoir des modèles animaux qui reflètent le système immunitaire humain et ses réponses afin de faciliter la poursuite de la recherche sur le VIH. Plusieurs types de souris humanisées qui sont capables de soutenir l’engraftment cellulaire et tissulaire ont été développés en transplantant des cellules humaines dans des souris sévèrement immunodéficientes2. Ces souris humanisées sont sensibles à l’infection par le VIH et constituent une alternative importante aux modèles non humains de virus de l’immunodéficience simienne des primates, car elles sont moins chères et plus simples à utiliser que les primates non humains. Les souris humanisées ont facilité la recherche sur la transmission virale du VIH, la pathogénie, la prévention et le traitement3,4,5,6,7,8,9,10,11.

Nous présentons un système modèle humanisé flexible pour la recherche sur le VIH mis au point en transplantant des cellules souches humaines dérivées du sang de cordon ombilical chez des souris de la NoD. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Sug/JicTac (NOG) fond. En plus d’être d’origine non fœtale, la bioingénierie pratique de ces souris est moins exigeante techniquement par rapport aux procédures microchirurgicales impliquées dans la transplantation de la construction sang-foie-thymus (BLT).

Nous montrons comment établir l’infection par le VIH par transmission intravaginale et comment surveiller la charge virale plasmatique avec une configuration pcR numérique sensible de gouttelette (ddPCR). Par la suite, nous décrivons l’établissement de la cART standard donnée dans le cadre du régime quotidien de souris. L’objectif de ces méthodes combinées est de réduire le stress pour les animaux et de faciliter les expériences à grande échelle où le temps passé à manipuler chaque animal est limité12.

Chez l’homme, un génotype CCR5no 32/wt ou CCR55 et32 cause une réduction de la sensibilité à l’infection par le VIH par les virus émetteurs/fondateurs13, et certaines précautions doivent être prises lorsque la bioingénierie humanise des souris avec des cellules souches aux fins d’études sur le VIH. Cela est particulièrement vrai dans notre région parce que les variantes naturelles du gène CCR5, en particulier les suppressions de 32 euros, sont plus répandues dans les populations indigènes scandinaves et baltes que dans le reste du monde14,15. Ainsi, notre protocole inclut un test facile et à haut débit pour le dépistage des cellules souches hématopoïétiques des donneurs pour les variantes CCR5 avant la transplantation.

Pour l’exposition intravaginale nous avons choisi l’émetteur/fondateur R5 virus RHPA4259, isolé d’une femme dans un stade précoce de l’infection qui a été infecté intravaginally16. Nous avons exposé les souris à une dose virale qui était suffisante pour produire une transmission réussie dans la majorité des souris, mais en dessous d’un taux de transmission de 100%. Le choix d’une telle dose permet une plage dynamique suffisante du taux de transmission, de sorte que les effets antiviraux d’un candidat médicament peuvent entraîner des animaux protégés dans des expériences de prévention du VIH et une diminution de la charge virale pour les études de traitement.

Protocol

Tous les échantillons de sang de cordon ont été obtenus en conformité stricte avec les protocoles approuvés localement, y compris le consentement éclairé du don anonyme par les parents. Toutes les expériences sur les animaux ont été approuvées et réalisées conformément à la réglementation nationale danoise en vertu de la licence 2017-15-0201-01312. CAUTION : Manipulez les souris et le sang exposés au VIH avec une extrême prudence. Décontaminer toutes les surfaces et les liqu…

Representative Results

La stratégie de gating pour l’analyse de la pureté des cellules souches est représentée dans la figure 1. La figure 1A-C montre la population purifiée de CD34MD et la figure 1D-F le flux CD34 utilisé pour illustrer que la quantité minimale de la population de CD34 Est perdue dans le processus d’isolement. La pureté des cellules souches isolées CD34MD se trouvait entre 85 % et 95 % avec moin…

Discussion

La souche de souris sévèrement immunocompromise NOD. Cg-PrkdccidIl2rgtm1Sug/JicTac (NOG) est extrêmement bien adapté pour la transplantation de cellules et de tissus humains. Les voies immunitaires innées et adaptatives chez ces souris sont compromises. Les souris NOG et NSG abritent une mutation descid de Prkdc qui a comme conséquence la fonction défectueuse de cellules de T et de B. En outre, ces souris n’ont pas un récepteur fonctionnel inter…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les auteurs tient à remercier le personnel de l’établissement pour animaux de biomédecine de l’Université d’Aarhus, en particulier Mme Jani Kûr pour les efforts d’entretien des colonies et pour le suivi du poids des souris. Les auteurs tiennent à remercier le professeur Florian Klein d’avoir développé une norme de soins et d’avoir été guidé. Le réactif suivant a été obtenu par l’entremise du Programme des agents de lutte contre le sida des NIH, Division du sida, NIAID, NIH : pRHPA.c/2635 (cat 11744) du Dr John Kappes et de la Dre Christina Ochsenbauer.

Materials

Blue pad VWR 56616-031 Should be sterilized prior to use
Bovine serum albumin (BSA) Sigma A8022
CD19 (clone sj25c1) PE-Cy7 BD Bioscience 557835
CD3 (clone OKT3) FITC Biolegend 317306
CD3 (clone SK7) BUV395 BD Bioscience 564001
CD34 (clone AC136) FITC Miltenyi 130-113-740
CD4 (clone SK3) BUV 496 BD Bioscience 564652/51
CD45 (clone 2D1) APC Biolegend 368511/12
CD8 (clone RPA-T8) BV421 BD Bioscience 562428
ddPCR Supermix for probes (no dUTP) Bio-Rad 1863025
DMSO Merck 10,02,95,21,000
DNAse Sigma D4263 For suspension buffer
dNTP mix Life Technologies R0192
Dulbeccos phosphate-buffered saline (PBS) Biowest L0615-500
EasySep Human Cord Blood CD34 Positive Selection Kit II Stemcell 17896
EDTA Invitrogen 15575-038
FACS Lysing solution 10X BD 349202 Dilute 1:10 in dH20 immediately before use
FACS tubes (Falcon 5 mL round-botton) Falcon 352052
Fc Receptor blocking solution (Human Trustain FcX) Biolegend 422302
Fetal bovine serum Sigma F8192-500
Ficoll-Paque PLUS GE Healthcare 17144002
Flowjo v.10
Gauze Mesoft 157300 Should be sterilized prior to use
Heating lamp Custom made
Hemacytometer (Bürker-Türk) VWR DOWC1597418
Isoflurane gas Orion Pharma 9658
LSR Fortessa X20 flow cytometer BD
Microcentrifuge tubes, PCR-PT approved Sarstedt 72692405
Mouse cART food ssniff Spezialdiäten GmbH Custom made product
Mouse restrainer Custom made product
Needle, Microlance 3, 30G ½" BD 304000
NOG mice NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug/JicTac Taconic NOG-F
Nuclease-free water VWR chemicals 436912C
Nucleospin 96 Virus DNA and RNA isolation kit Macherey-Nagel 740691
PCR-approved microcentrifuge tubes Sarstedt 72.692.405
Penicillin-Streptomycin solution 100X Biowest L0022-100
Phusion Hot Start II DNA polymerase Life Technologies F549S
Pipette tips, sterile, ART 20P Barrier ThermoScientific 2149P
Proteinase K NEB 100005398
QuantaSoft software Bio-Rad
QX100 Droplet Generator Bio-Rad 1886-3008
QX100 Droplet Reader Bio-Rad 186-3003
RBC lysis solution Biolegend 420301
RNase-free DNAse size F + reaction buffer Macherey-Nagel 740963
RNAseOUT Recombinant Ribonuclease inhibitor ThermoScientific 10777-019
RPMI Biowest L0501-500 Dissolve in H20
Softject 1 mL syringe Henke Sass Wolf 5010-200V0
Superscript III Reverse Transcriptase ThermoFisher Scientific 18080044
Thermoshaker VWR 89370-910
Trypane blue Sigma T8154
Ultrapure 0.5 EDTA, pH 8.0 ThermoFisher Scientific 15575-020
Virkon S (virus disinfectant) Dupont 7511

References

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Andersen, A. H. F., Nielsen, S. S. F., Olesen, R., Mack, K., Dagnæs-Hansen, F., Uldbjerg, N., Østergaard, L., Søgaard, O. S., Denton, P. W., Tolstrup, M. Humanized NOG Mice for Intravaginal HIV Exposure and Treatment of HIV Infection. J. Vis. Exp. (155), e60723, doi:10.3791/60723 (2020).

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