Здесь мы представляем протокол для проверки эффективности целевых методов лечения, отобранных на основе геномного состава опухоли. Протокол описывает идентификацию и проверку структурных перестановок ДНК, привитие опухолей пациентов в мышей и тестирование ответов на соответствующие препараты.
Мы представляем здесь интегративный подход для тестирования эффективности целевых методов лечения, который сочетает в себе следующее поколение секвенирования техноло-ги, терапевтических целевых анализов и мониторинга реакции на лекарства с использованием пациентов, полученных ксенотрансплантатов (PDX). Эта стратегия была подтверждена с использованием опухолей яичников в качестве примера. Протокол последовательности следующего поколения (MPseq) был использован для выявления структурных изменений, после чего был проведен анализ потенциально целевых изменений. Опухоли человека, выращенные у иммунокомпромиссных мышей, лечились препаратами, отобранными на основе геномного анализа. Результаты продемонстрировали хорошую корреляцию между прогнозируемыми и наблюдаемыми реакциями в модели PDX. Представленный подход может быть использован для проверки эффективности комбинированного лечения и оказания помощи персонализированным лечением пациентов с рецидивирующим раком, особенно в тех случаях, когда стандартная терапия не удается и существует необходимость использования лекарств от этикетки.
Ксенографты, полученные от пациентов (PDX), которые генерируются в результате имплантации частей опухоли пациента в иммунодефицитных мышей, стали мощной доклинической моделью для оказания персонализированной противораковой помощи. Модели PDX были успешно разработаны для различных злокачественных новообразований человека. К ним относятся рак молочной железы и яичников, злокачественная меланома, колоректальный рак, аденокарцинома поджелудочной железы, и немелкоклеточный рак легких1,2,3,4,5. Опухолевую ткань можно имплантировать ортопедически или гетеротопически. Первый, считается более точным, но технически трудно, включает в себя трансплантацию непосредственно в орган опухоли происхождения. Эти типы моделей, как полагают, точно имитировать гистологию оригинальной опухоли из-за “естественной” микроокружения для опухоли6,7. Например, ортотопическая трансплантация в бурсу яичника мыши привела к распространению опухоли в брюшной полости и выработке асцита, характерного для рака яичников8. Аналогичным образом, инъекция опухолей молочной железы в грудной клетки вместо брюшной молочной железы влияет на уровень успеха PDX и поведение9. Тем не менее, ортопедические модели требуют сложных систем визуализации для мониторинга роста опухоли. Гетеротопная имплантация твердой опухоли обычно выполняется путем имплантации ткани в подкожный фланг мыши, что позволяет легче контролировать рост опухоли и является менее дорогостоящим и трудоемким7. Тем не менее, опухоли, выращенные подкожной, редко метастазируют в отличие от наблюдаемых в случае ортопедической имплантации10.
Было показано, что скорость успешного ирования в него варьируется и в значительной степени зависит от типа опухоли. Более агрессивные опухоли и образцы тканей, содержащие более высокий процент опухолевых клеток, как сообщается, лучше успеха12,13. В соответствии с этим, опухоли, полученные из метастатических сайтов было показано, engraft на частотах 50-80%, в то время как те из первичных сайтов engraft на частотах, как низко как 14%12. В отличие от этого, ткани, содержащие некротические клетки и меньше жизнеспособных опухолевых клеток приопят плохо. Рост опухоли также может быть повышен путем добавления подвала мембраны матричных белков в ткани смеси во время инъекции в мышей14 без ущерба для свойств оригинальной опухоли. Было также установлено, что размер и количество частей тканей, предназначенных для имплантации, влияют на успешность имплантации. Большие опухоли принять ставки были зарегистрированы для имплантации в подпональная капсула по сравнению с подкожной имплантации из-за способности подпонаальной капсулы для поддержания первоначальной стромы опухоли и обеспечить принимающей стромальных клеток, а также15.
Большинство исследований используют NOD / SCID иммунодефицитных мышей, которые не имеют естественных клеток-убийц16 и было показано, что увеличение опухоли engraftment, рост и метастазы по сравнению с другими штаммами14. Тем не менее, дополнительный мониторинг требуется, поскольку они могут развиваться тимимы лимфомы уже в 3-4 месяца в возрасте13лет. В трансплантации опухоли яичников, выращенных у SCID мышей, рост В-клеток был успешно ингибируется ритуксимаб, предотвращая развитие лимфомы, но без влияния на инплантирование опухолей яичников17.
Совсем недавно, NSG (NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) мышей, неся нулевую мутацию в гене кодирования интерлейкина 2 рецептора гамма-цепи18, стал часто используемым штаммом для поколения моделей PDX. Опухоли от установленных моделей PDX, передавшихся будущим поколенияммышей,как сообщается, сохраняют гистологические и молекулярные свойства в течение 3 до 6 поколений19,20. Многочисленные исследования показали, что результаты лечения в моделях PDX имитируют результаты соответствующих пациентов2,,3,,4,,21,,22,,23. Скорость реакции на химиотерапию в моделях PDX для немалых рака легких и колоректальной карциномы была аналогична той, что в клинических испытаниях для тех же препаратов24,25. Исследования, проведенные в моделях PDX, разработанные для пациентов, зачисленных в клинические испытания, продемонстрировали ответы на проверенные препараты, аналогичныетем,которые наблюдаются клинически у соответствующих пациентов2,3,,4.
Геномный анализ опухоли пациента с высокой пропускной способностью в сочетании с моделями PDX является мощным инструментом для изучения корреляций между конкретными геномными изменениями и терапевтической реакцией. Они были описаны в нескольких публикациях26,27. Например, терапевтические реакции на ингибитор EGFR cetuximab в наборе колоректальных моделей PDX, несущих усиление EGFR, параллельные клинические реакции на цетуксимаб у пациентов28.
Есть несколько проблем, связанных с разработкой и применением моделей PDX. Среди них неоднородность опухоли29,30, которые могут поставить под угрозу точность интерпретации реакции лечения в качестве одного клона клетки с более высокой пролиферативной способностью в PDX может перерасти другие31, что приводит к потере неоднородности., Кроме того, когда один биопсии опухоли используются для разработки PDX, некоторые из популяций клеток могут быть пропущены и не будут представлены в окончательном трансплантата. Несколько образцов из одной и той же опухоли рекомендуется для имплантации, чтобы решить эту проблему. Хотя ОПУХОЛи PDX, как правило, содержат все типы клеток первоначальной донорской опухоли, эти клетки постепенно заменяются опухолями муринского происхождения3. Взаимодействие между муринской стромой и опухолевыми клетками человека в моделях PDX не очень хорошо изучено. Тем не менее, стромальные клетки были показаны, чтобы резюмировать микроэквипедииопухоли 33.
Несмотря на эти ограничения, модели PDX остаются одними из наиболее ценных инструментов для трансляционных исследований, а также персонализированной медицины для выбора лечения пациентов. Основные применения PDXs включают биомаркер обнаружения и тестирования на наркотики. Модели PDX также успешно используются для изучения механизмов лекарственной устойчивости и определения стратегий по преодолению лекарственной устойчивости34,,35. Подход, описанный в настоящей рукописи, позволяет исследователю выявлять потенциальные терапевтические цели в опухолях человека и оценивать эффективность соответствующих препаратов in vivo , умышей, укрывающих привитые опухоли, которые изначально были геномно охарактеризованы. Протокол использует опухоли яичников, привитые интраперитонально, но применимы к любому типу опухоли достаточно агрессивным, чтобы расти у мышей2,,3,12.
Мы описываем подход и протоколы, которые мы использовали для проведения «клинических испытаний» в моделях PDX, которые используют молекулярные характеристики опухоли, полученные путем геномного профилирования, чтобы определить лучший выбор препаратов для тестирования. Несколько плат…
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим членов Клиники Майо Центр индивидуальной медицины (CIM) д-р Лин Ян и Фэй Р. Харрис, MS, за помощь в проведении экспериментов. Эта работа была поддержана г-н и г-жа Нил Е. Эклс ‘Подарок в клинике Майо Центр индивидуальной медицины (CIM).
3M Vetbond | 3M, Co. | 1469SB | |
anti-AKT antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 9272 | |
Anti-GAPDH antibody(G-9) | Santa Cruz Biotech. Inc. | sc-365062 | |
Anti-MAPK antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 9926 | |
Anti-phospho-AKT antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 9271 | |
Anti-mTOR antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 2972 | |
Anti-Phospho-mTOR antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 2971 | |
Anti-Phospho-S6 antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 4858 | |
Anti-Rictor antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 2114 | |
Anti-S6 antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 2217 | |
Captisol | ChemScene, Inc. | cs-0731 | |
Carboplatin | NOVAPLUS, Inc. | 61703-360-18 | |
DMEM | Mediatech, Inc. | 10-013-CV | |
Easy-A Hi-Fi PCR Cloning Enzyme | Agilent, Inc. | 600404-51 | |
Lubricant | Cardinal Healthcare | 82-280 | |
Matrigel | Corning, Inc. | 356234 | |
McCoy's media | Mediatech, Inc. | 10-050-CV | |
MK-2206 | ApexBio, Inc. | A3010 | |
MK-8669 | ARIAD Pharmaceuticals, Inc. | AP23573 | |
Nair Sensitive Skin | Church & Dwight Co. | Nair Hair Remover Shower Power Sensitive | |
NOD/SCID mice | Charles River, Inc. | NOD.CB17-Prkdcscid/NCrCrl | |
Paclitaxel | NOVAPLUS, Inc. | 55390-304-05 | |
PEG400 | Millipore Sigma, Inc. | 88440-250ML-F | |
Perjeta | Genetech, Co. | Pertuzumab | |
Rituximab | Genetech, Co. | Rituxan | |
RPMI1640 | Mediatech, Inc. | 10-040-CV | |
SCID mice | Harlan Laboratories, Inc. | C.B.-17/IcrHsd-PrkdcscidLystbg | |
SLAx 13-6MHz linear transducer | FUJIFILM SonoSite, Inc | HFL38xp | |
SonoSite S-series Ultrasound machine | FUJIFILM SonoSite, Inc | SonoSite SII | |
Tween 80 | Millipore Sigma, Inc. | P4780-100ML |