Testen gerichte therapieën bij kanker met behulp van structurele DNA-wijzigingsanalyse en patiënt-afgeleide Xenografts
Summary
Hier presenteren we een protocol om de werkzaamheid van gerichte therapieën geselecteerd op basis van de genomische samenstelling van een tumor te testen. Het protocol beschrijft identificatie en validatie van structurele DNA-herschikkingen, engraftmentatie van tumoren van patiënten in muizen en het testen van reacties op overeenkomstige geneesmiddelen.
Abstract
We presenteren hier een integratieve aanpak voor het testen van de werkzaamheid van gerichte therapieën die de volgende generatie sequencing technolo-gies, therapeutische doelanalyses en drug response monitoring met behulp van patiënt afgeleide xenografts (PDX) combineert. Deze strategie werd gevalideerd met behulp van eierstoktumoren als voorbeeld. Het mate-pair next generation sequencing (Mpeq) protocol werd gebruikt om structurele wijzigingen te identificeren en gevolgd door analyse van potentieel gerichte wijzigingen. Menselijke tumoren gekweekt in immuungecompromitteerde muizen werden behandeld met geneesmiddelen geselecteerd op basis van de genomische analyses. De resultaten toonden een goede correlatie aan tussen de voorspelde en de waargenomen reacties in het PDX-model. De gepresenteerde aanpak kan worden gebruikt om de werkzaamheid van combinatiebehandelingen te testen en gepersonaliseerde behandeling te helpen voor patiënten met terugkerende kanker, met name in gevallen waarin standaardtherapie mislukt en er een noodzaak is om geneesmiddelen off label te gebruiken.
Introduction
Patiënt-afgeleide xenografts (PDXs), die worden gegenereerd uit de implantatie van patiënt tumor stukken in immunodeficient muizen, zijn naar voren gekomen als een krachtig preklinisch model om gepersonaliseerde anti-kanker zorg te helpen. PDX modellen zijn met succes ontwikkeld voor een verscheidenheid van menselijke maligniteiten. Deze omvatten borst- en eierstokkanker, kwaadaardig melanoom, colorectale kanker, alvleesklieradenocarcinoom en niet-kleincellige longkanker1,,2,,3,,4,,5. Tumorweefsel kan orthotopisch of heterotopisch worden geïmplanteerd. De eerste, beschouwd als nauwkeuriger, maar technisch moeilijk, gaat transplantatie rechtstreeks in het orgaan van tumor oorsprong. Deze soorten modellen worden verondersteld om precies na te bootsen histologie van de oorspronkelijke tumor als gevolg van de “natuurlijke” micro-omgeving voor de tumor6,7. Bijvoorbeeld, orthotopische transplantatie in de slijmbeurs van de muis eierstok resulteerde in tumor verspreiding in de buikvliesholte en de productie van ascites, typisch voor eierstokkanker8. Evenzo beïnvloedde injectie van borsttumoren in het borstvuur in plaats van de buikklier het PDX-slagingspercentage en gedrag9. Orthotopische modellen vereisen echter geavanceerde beeldvormingssystemen om de tumorgroei te monitoren. Heterotopische implantatie van vaste tumor wordt meestal uitgevoerd door het implanteren van weefsel in de onderhuidse flank van een muis die het mogelijk maakt voor een gemakkelijkere monitoring van tumorgroei en is minder duur en tijdrovend7. Echter, tumoren gegroeid onderhuids zelden metastaseren in tegenstelling tot zoals waargenomen in het geval van orthotopische implantatie10.
Het slagingspercentage van engraftment is aangetoond dat variëren en sterk afhankelijk van het tumortype. Meer agressieve tumoren en weefselmonsters met een hoger percentage van de tumorcellen werden gemeld aan een betere slagingspercentages12,13hebben . In overeenstemming met deze, tumoren afgeleid van gemetastaste sites werden aangetoond dat engraft op frequenties van 50-80%, terwijl die van primaire sites engraft op frequenties zo laag als 14%12. Weefsel dat necrotische cellen en minder levensvatbare tumorcellen bevat, is daarentegen slecht. Tumorgroei kan ook worden bevorderd door de toevoeging van keldermembraanmateneiwitten in de weefselmix op het moment van de injectie in muizen14 zonder afbreuk te doen aan de eigenschappen van de oorspronkelijke tumor. De grootte en het aantal weefselstukken bestemd voor implantatie bleken ook het slagingspercentage van engraftment beïnvloeden. Grotere tumor take-rates werden gemeld voor implantatie in de sub-nier capsule in vergelijking met onderhuidse implantatie als gevolg van het vermogen van de sub-nier capsule om de oorspronkelijke tumor stroma te handhaven en de gastheer stromalcellenevenals 15.
De meeste studies gebruiken NOD/ SCID immunodeficient muizen, die geen natuurlijke killer cellen16 en is aangetoond dat het verhogen van de tumor engraftment, groei en metastase in vergelijking met andere stammen14. Er is echter extra monitoring nodig omdat ze thymische lymfomen kunnen ontwikkelen vanaf 3-4 maanden13 jaar. Bij eierstoktumortransplantaties gekweekt in SCID muizen, werd de uitgroei van B-cellen met succes geremd door rituximab, het voorkomen van de ontwikkeling van lymfoom, maar zonder invloed op de engraftment van de eierstokkanker tumoren17.
Meer recent, NSG (NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) muizen, die een null mutatie in het gen coderen van de interleukine 2 receptor gamma keten18, werd een veelgebruikte stam voor de generatie van PDX modellen. Tumoren van gevestigde PDX-modellen die naar toekomstige generaties muizen worden doorgegangerd, behouden naar verluidt histologische en moleculaire eigenschappen gedurende 3 tot 6 generaties19,20. Talrijke studies hebben aangetoond dat de behandelingsresultaten in PDX-modellen die van hun overeenkomstige patiëntennabootsen 2,3,4,21,22,23. Het responspercentage op chemotherapie in PDX-modellen voor niet-kleine longkanker en colorectale carcinomen was vergelijkbaar met die in klinische studies voor dezelfde geneesmiddelen24,25. Studies uitgevoerd in PDX-modellen, ontwikkeld voor patiënten die waren ingeschreven in klinische studies, toonden aan dat er reacties waren op geteste geneesmiddelen die vergelijkbaar zijn met die waargenomen bij overeenkomstige patiënten2,3,4.
Genomische analyses met hoge doorvoer van een patiënttumor in combinatie met PDX-modellen bieden een krachtig hulpmiddel om correlaties tussen specifieke genomische veranderingen en een therapeutische respons te bestuderen. Deze zijn beschreven in enkele publicaties26,27. Bijvoorbeeld, therapeutische reacties op de EGFR-remmer cetuximab in een set van colorectale PDX-modellen met EGFR-versterking, parallelle klinische reacties op cetuximab bij patiënten28.
Er zijn een paar uitdagingen verbonden aan de ontwikkeling en toepassing van PDX-modellen. Onder die is tumor heterogeniteit29,30 die de nauwkeurigheid van de behandeling respons interpretatie kan compromitteren als een eencellige kloon met een hogere proliferative capaciteit binnen een PDX kan ontgroeien de andere31, wat resulteert in een verlies van heterogeniteit. Bovendien, wanneer eentumor biopten worden gebruikt om PDX te ontwikkelen, kunnen sommige van de cel populaties worden gemist en zal niet worden vertegenwoordigd in de uiteindelijke graft. Meerdere monsters van dezelfde tumor worden aanbevolen voor implantatie om dit probleem op te lossen. Hoewel PDX-tumoren de neiging hebben om alle celtypen van de oorspronkelijke donortumor te bevatten, worden deze cellen geleidelijk vervangen door die van murineoorsprong3. Het samenspel tussen murine stroma en menselijke tumorcellen in PDX-modellen is niet goed begrepen. Niettemin, stromalcellen werden aangetoond dat tumor micro-omgeving33recapituleren .
Ondanks deze beperkingen blijven PDX-modellen een van de meest waardevolle instrumenten voor translationeel onderzoek en gepersonaliseerde geneeskunde voor het selecteren van patiënttherapieën. Belangrijke toepassingen van PDX’s zijn biomarker discovery en drug testing. PDX-modellen worden ook met succes gebruikt om resistentiemechanismen voor geneesmiddelen te bestuderen en strategieën te identificeren om resistentie tegen geneesmiddelen te overwinnen34,35. De in het onderhavige manuscript beschreven aanpak stelt de onderzoeker in staat om potentiële therapeutische doelen in menselijke tumoren te identificeren en de werkzaamheid van overeenkomstige geneesmiddelen in vivo tebeoordelen, bij muizen die gegrafeerde tumoren herbergen die aanvankelijk genomically werden gekarakteriseerd. Het protocol maakt gebruik van eierstoktumoren geïnnaleerd intraperitoneally, maar is van toepassing op elk type tumor voldoende agressief om te groeien in muizen2,3,12.
Protocol
Representative Results
Discussion
We beschrijven de aanpak en protocollen die we gebruikten om een “klinische studie” uit te voeren in PDX-modellen die gebruik maken van moleculaire kenmerken van de tumor zoals verkregen door genomische profilering om de beste keuze van geneesmiddelen voor het testen te bepalen. Meerdere sequencing platforms worden momenteel gebruikt voor genomische karakterisering van primaire tumoren, waaronder hele genoom sequencing, RNAseq en aangepaste genpanelen. Voor hoogwaardig sereuze ovariële carcinoom, Mpeq om structurele ver…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken de leden van het Mayo Clinic Center for Individualized Medicine (CIM) Dr. Lin Yang en Faye R. Harris, MS, voor de hulp bij het uitvoeren van experimenten. Dit werk werd ondersteund door de heer en mevrouw Neil E. Eckles ‘Gift aan de Mayo Clinic Center for Individualized Medicine (CIM).
Materials
| 3M Vetbond | 3M, Co. | 1469SB | |
| anti-AKT antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 9272 | |
| Anti-GAPDH antibody(G-9) | Santa Cruz Biotech. Inc. | sc-365062 | |
| Anti-MAPK antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 9926 | |
| Anti-phospho-AKT antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 9271 | |
| Anti-mTOR antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 2972 | |
| Anti-Phospho-mTOR antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 2971 | |
| Anti-Phospho-S6 antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 4858 | |
| Anti-Rictor antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 2114 | |
| Anti-S6 antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 2217 | |
| Captisol | ChemScene, Inc. | cs-0731 | |
| Carboplatin | NOVAPLUS, Inc. | 61703-360-18 | |
| DMEM | Mediatech, Inc. | 10-013-CV | |
| Easy-A Hi-Fi PCR Cloning Enzyme | Agilent, Inc. | 600404-51 | |
| Lubricant | Cardinal Healthcare | 82-280 | |
| Matrigel | Corning, Inc. | 356234 | |
| McCoy's media | Mediatech, Inc. | 10-050-CV | |
| MK-2206 | ApexBio, Inc. | A3010 | |
| MK-8669 | ARIAD Pharmaceuticals, Inc. | AP23573 | |
| Nair Sensitive Skin | Church & Dwight Co. | Nair Hair Remover Shower Power Sensitive | |
| NOD/SCID mice | Charles River, Inc. | NOD.CB17-Prkdcscid/NCrCrl | |
| Paclitaxel | NOVAPLUS, Inc. | 55390-304-05 | |
| PEG400 | Millipore Sigma, Inc. | 88440-250ML-F | |
| Perjeta | Genetech, Co. | Pertuzumab | |
| Rituximab | Genetech, Co. | Rituxan | |
| RPMI1640 | Mediatech, Inc. | 10-040-CV | |
| SCID mice | Harlan Laboratories, Inc. | C.B.-17/IcrHsd-PrkdcscidLystbg | |
| SLAx 13-6MHz linear transducer | FUJIFILM SonoSite, Inc | HFL38xp | |
| SonoSite S-series Ultrasound machine | FUJIFILM SonoSite, Inc | SonoSite SII | |
| Tween 80 | Millipore Sigma, Inc. | P4780-100ML |
References
- Tentler, J. J., et al. Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development. Nature Reviews Clinical Oncology. 9, 338-350 (2012).
- Marangoni, E., et al. A new model of patient tumor-derived breast cancer xenografts for preclinical assays. Clinical Cancer Research. 13, 3989-3998 (2007).
- Zhang, X., et al. A renewable tissue resource of phenotypically stable, biologically and ethnically diverse, patient-derived human breast cancer xenograft models. Cancer Research. 73, 4885-4897 (2013).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4, 998-1013 (2014).
- Weroha, S. J., et al. Tumorgrafts as in vivo surrogates for women with ovarian cancer. Clinical Cancer Research. 20, 1288-1297 (2014).
- Rubio-Viqueira, B., et al. Optimizing the development of targeted agents in pancreatic cancer: tumor fine-needle aspiration biopsy as a platform for novel prospective ex vivo drug sensitivity assays. Molecular Cancer Therapeutics. 6, 1079-1088 (2007).
- Rubio-Viqueira, B., Hidalgo, M. Direct in vivo xenograft tumor model for predicting chemotherapeutic drug response in cancer patients. Clinical Pharmacology and Therapeutics. 85, 217-221 (2009).
- Ricci, F., et al. Patient-derived ovarian tumor xenografts recapitulate human clinicopathology and genetic alterations. Cancer Research. 74, 6980-6990 (2014).
- Fleming, J. M., et al. Local regulation of human breast xenograft models. Journal of Cellular Physiology. 224, 795-806 (2010).
- Hoffman, R. M. Patient-derived orthotopic xenografts: better mimic of metastasis than subcutaneous xenografts. Nature Reviews Cancer. 15, 451-452 (2015).
- Jung, J., Seol, H. S., Chang, S. The Generation and Application of Patient-Derived Xenograft Model for Cancer Research. Cancer Research and Treatment. 50, 1-10 (2018).
- Sivanand, S., et al. A validated tumorgraft model reveals activity of dovitinib against renal cell carcinoma. Science Translational Medicine. 4, 137-152 (2012).
- Pavía-Jiménez, A., Tcheuyap, V. T., Brugarolas, J. Establishing a human renal cell carcinoma tumorgraft platform for preclinical drug testing. Nature Protocols. 9, 1848-1859 (2014).
- Fridman, R., Benton, G., Aranoutova, I., Kleinman, H. K., Bonfil, R. D. Increased initiation and growth of tumor cell lines, cancer stem cells and biopsy material in mice using basement membrane matrix protein (Cultrex or Matrigel) co-injection. Nature Protocols. 7, 1138-1144 (2012).
- Cutz, J. C., et al. Establishment in severe combined immunodeficiency mice of subrenal capsule xenografts and transplantable tumor lines from a variety of primary human lung cancers: potential models for studying tumor progression-related changes. Clinical Cancer Research. 12, 4043-4054 (2006).
- Siolas, D., Hannon, G. J. Patient-derived tumor xenografts: transforming clinical samples into mouse models. Cancer Research. 73, 5315-5319 (2013).
- Butler, K. A., et al. Prevention of Human Lymphoproliferative Tumor Formation in Ovarian Cancer Patient-Derived Xenografts. Neoplasia. 19, 628-636 (2017).
- Cao, X., et al. Defective lymphoid development in mice lacking expression of the common cytokine receptor gamma chain. Immunity. 2, 223-238 (1995).
- Dobbin, Z. C., et al. Using heterogeneity of the patient-derived xenograft model to identify the chemoresistant population in ovarian cancer. Oncotarget. 5, 8750-8764 (2014).
- Choi, Y. Y., et al. Establishment and characterisation of patient-derived xenografts as paraclinical models for gastric cancer. Scientific Reports. 6, 22172 (2016).
- Malaney, P., Nicosia, S. V., Davé, V. One mouse, one patient paradigm: New avatars of personalized cancer therapy. Cancer Letters. 344, 1-12 (2014).
- Rosfjord, E., Lucas, J., Li, G., Gerber, H. P. Advances in patient-derived tumor xenografts: from target identification to predicting clinical response rates in oncology. Biochemical Pharmacology. 91, 135-143 (2014).
- Braekeveldt, N., Bexell, D. Patient-derived xenografts as preclinical neuroblastoma models. Cell and Tissue Research. 372, 233-243 (2018).
- ‘Perez-Soler, R., et al. Response and determinants of sensitivity to paclitaxel in human non-small cell lung cancer tumors heterotransplanted in nude mice. Clinical Cancer Research. 6, 4932-4938 (2000).
- Fichtner, I., et al. Anticancer drug response and expression of molecular markers in early-passage xenotransplanted colon carcinomas. European Journal of Cancer. 40, 298-307 (2004).
- Gao, H., et al. High-throughput screening using patient-derived tumor xenografts to predict clinical trial drug response. Nature Medicine. 21, 1318-1325 (2015).
- Izumchenko, E., et al. Patient-derived xenografts effectively capture responses to oncology therapy in a heterogeneous cohort of patients with solid tumors. Annals of Oncology. 28, 2595-2605 (2017).
- Bertotti, A., et al. A molecularly annotated platform of patient-derived xenografts (“xenopatients”) identifies HER2 as an effective therapeutic target in cetuximab-resistant colorectal cancer. Cancer Discovery. 1, 508-523 (2011).
- Mengelbier, L. H., et al. Intratumoral genome diversity parallels progression and predicts outcome in pediatric cancer. Nature Communications. 27, 6125 (2015).
- McGranahan, N., Swanton, C. Clonal Heterogeneity and Tumor Evolution: Past, Present, and the Future. Cell. 168, 613-628 (2017).
- Marusyk, A., et al. Non-cell-autonomous driving of tumour growth supports sub-clonal heterogeneity. Nature. 514, 54-58 (2014).
- Braekeveldt, N., et al. Neuroblastoma patient-derived orthotopic xenografts reflect the microenvironmental hallmarks of aggressive patient tumours. Cancer Letters. 375, 384-389 (2016).
- DeRose, Y. S., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nature Medicine. 17, 1514-1520 (2011).
- Das Thakur, M., et al. Modelling vemurafenib resistance in melanoma reveals a strategy to forestall drug resistance. Nature. 494, 251-255 (2013).
- Girotti, M. R., et al. Application of Sequencing, Liquid Biopsies, and Patient-Derived Xenografts for Personalized Medicine in Melanoma. Cancer Discovery. 6, 286-299 (2016).
- Murphy, S. J., et al. Mate pair sequencing of whole-genome-amplified DNA following laser capture microdissection of prostate cancer. DNA Research. 19, 395-406 (2012).
- Smadbeck, J. B., et al. Copy number variant analysis using genome-wide mate-pair sequencing. Genes Chromosomes and Cancer. 57, 459-470 (2018).
- Kovtun, I. V., et al. Lineage relationship of Gleason patterns in Gleason score 7 prostate cancer. Cancer Research. 73, 3275-3284 (2013).
- Paster, E. V., Villines, K. A., Hickman, D. L. Endpoints for mouse abdominal tumor models: refinement of current criteria. Comparative Medicine. 59, 234-241 (2009).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9, 671-675 (2012).
- Cheng, Y., et al. MK-2206, a novel allosteric inhibitor of Akt, synergizes with gefitinib against malignant glioma via modulating both autophagy and apoptosis. Molecular Cancer Therapeutics. 11, 154-164 (2012).
- Rivera, V. M., et al. Ridaforolimus (AP23573; MK-8669), a potent mTOR inhibitor, has broad antitumor activity and can be optimally administered using intermittent dosing regimens. Molecular Cancer Therapeutics. 10, 1059-1071 (2011).
- Heitjan, D. F., Manni, A., Santen, R. J. Statistical analysis of in vivo tumor growth experiments. Cancer Research. 53, 6042-6050 (1993).
- Vargas, R., et al. Case study: patient-derived clear cell adenocarcinoma xenograft model longitudinally predicts treatment response. NPJ Precision Oncology. 2, 14 (2018).
- Harris, F. R., et al. Targeting HER2 in patient-derived xenograft ovarian cancer models sensitizes tumors to chemotherapy. Molecular Oncology. 13, 132-152 (2019).
- Fidler, I. J., et al. Modulation of tumor cell response to chemotherapy by the organ environment. Cancer and Metastasis Reviews. 13, 209-222 (1994).
