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Cancer Research

構造DNA改変解析と患者由来異種移植片を用いたがんの標的治療の試験

Published: July 25, 2020
doi:
10.3791/60646
,
1Center for Individualized Medicine,Mayo Clinic, 2Department of Molecular Pharmacology and Experimental Therapeutics,Mayo Clinic

Summary

ここでは、腫瘍のゲノム構成に基づいて選択された標的療法の有効性を試験するプロトコルを提示する。このプロトコルは、構造的DNA再構成の同定と検証、患者の腫瘍のマウスへの生着、および対応する薬物に対する応答のテストを記述する。

Abstract

ここでは、次世代シーケンシングテクノギー、治療対象分析、患者由来異種移植片(PDX)を用いた薬物応答モニタリングを組み合わせた標的療法の有効性をテストするための統合的なアプローチを紹介します。この戦略は、例として卵巣腫瘍を使用して検証されました.mate ペア次世代シーケンシング(MpPeq)プロトコルは、構造変化を特定し、その後、潜在的に標的可能な変更の分析に使用されました。免疫不全マウスで増殖したヒト腫瘍は、ゲノム解析に基づいて選択された薬物で治療した。結果は、PDXモデルにおける予測応答と観測応答との間の良好な相関を示した。提示されたアプローチは、組み合わせ治療の有効性をテストし、特に標準的な治療が失敗し、ラベル外の薬物を使用する必要がある場合に、再発癌患者のためのパーソナライズされた治療を支援するために使用することができる。

Introduction

患者由来の異種移植片(PDXs)は、患者の腫瘍片を免疫不全マウスに移植して生成し、パーソナライズされた抗癌ケアを支援する強力な前臨床モデルとして登場した。PDXモデルは、さまざまなヒト悪性腫瘍のために開発に成功しています。これらには、乳癌および卵巣癌、悪性黒色腫、大腸癌、膵臓腺癌、および非小細胞肺癌11、2、3、4、52,3,4,5が含まれる。腫瘍組織は、異所性または異所性に移植することができる。前者は、より正確であるが技術的に困難であると考えられ、腫瘍起源の器官に直接移植することを含む。これらのタイプのモデルは、腫瘍,6,7の「自然」微小環境のために、元の腫瘍の組織学を正確に模倣すると考えられている。例えば、マウス卵巣のブルサへの異形性移植は、腹腔への腫瘍の播種および腹水の産生をもたらし、卵巣癌8の典型的な。同様に、腹部乳腺の代わりに胸部腫瘍を胸部に注入すると、PDXの成功率と行動9に影響を及した。しかし、直交性のモデルには、腫瘍の成長を監視するための高度なイメージングシステムが必要です。固形腫瘍の異所性移植は、典型的には、腫瘍の成長の容易なモニタリングを可能にし、より安価で時間のかかるマウスの皮下側面に組織を移植することによって行われる7。しかしながら、皮下に成長した腫瘍は、正交性移植10の場合に観察されたように転移することはほとんどありません。

生着の成功率は、腫瘍の種類によって異なり、大きく依存することが示されている。より高い割合の腫瘍細胞を含むより積極的な腫瘍および組織標本は、より良い成功率12,13,13を有することが報告された。これと一致して、転移部位に由来する腫瘍は50〜80%の頻度で生着することが示され、原発部位からの腫瘍は14%の低い頻度で生着する。対照的に、壊死細胞を含む組織は、生存可能な腫瘍細胞が少ないが、生着が悪い。腫瘍増殖はまた、元の腫瘍の特性を損なうことなくマウス14への注入時の組織ミックスに基膜マトリックスタンパク質を加えることによって促進することができる。移植を目的とした組織片の大きさと数は、生着の成功率に影響を与えることも判明した。より大きな腫瘍取り速度は、元の腫瘍間質を維持し、宿主間質細胞を提供するサブ腎嚢の能力による皮下移植と比較して、腎臓下のカプセルへの移植のために報告された。

ほとんどの研究は、NOD/SCID免疫不全マウスを使用し、これはナチュラルキラー細胞16を欠き、他の株14と比較して腫瘍の生着、成長および転移を増加させることが示されている。しかし、13歳の早い時期に3~4ヶ月の間に胸腺リンパ腫を発症する可能性があるため、追加のモニタリングが必要である。SCIDマウスで増殖した卵巣腫瘍移植では、B細胞の成長はリツキシマブによって正常に阻害され、リンパ腫の発症を予防するが、卵巣腫瘍17の生着に影響を与えない。

最近では、NSG(NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ)マウスは、インターロイキン2受容体γ鎖18をコードする遺伝子にヌル突然変異を運び、PDXモデルの生成に頻繁に使用される株となった。確立されたPDXモデルからマウスの将来の世代に継代された腫瘍は、3〜6世代の19、20,20の組織学的および分子特性を保持すると報告されている。多くの研究は、PDXモデルの治療結果が,対応する患者2、3、4、21、22、233,の患者のものを模倣することを示,21,22している。2423非小肺癌および大腸癌に対するPDXモデルにおける化学療法に対する応答率は、同じ薬剤24,25,25の臨床試験におけるそれと同様であった。臨床試験に登録された患者のために開発されたPDXモデルで行われた研究は、対応する患者22、3、43で臨床的に観察されたものと同様の試験薬に対する応答を実証した。

PDXモデルと組み合わせた患者腫瘍のハイスループットゲノム解析は、特定のゲノム変化と治療応答との間の相関関係を研究するための強力なツールを提供します。これらはいくつかの出版物26,27,27に記載されている。例えば、EGFR阻害剤セツキシマブに対する治療応答は、EGFR増幅を担う大腸PDXモデルのセットにおいて、患者28におけるセツキシマブに対する並行した臨床的応答である。

PDX モデルの開発と適用に関連するいくつかの課題があります。その中には、PDX内でより高い増殖能力を有する単一細胞クローンとしての治療応答解釈の精度を損なう可能性のある腫瘍不均一性29、30,30が、他のもの31を上回ることができ、したがって異質性の喪失をもたらす。さらに、PDXの開発に単一腫瘍生検を使用すると、細胞集団の一部が見逃され、最終的な移植片では表されない。この問題を解決するために、同じ腫瘍からの複数のサンプルが移植に推奨されます。PDX腫瘍は、元のドナー腫瘍のすべての細胞型を含む傾向があるが、これらの細胞は、マウス起源3のものに徐々に置換される。PDXモデルにおけるマウス間質とヒト腫瘍細胞の相互作用はよく理解されていない。それにもかかわらず、間質細胞は腫瘍微小環境33を再現することが示された。

これらの制限にもかかわらず、PDXモデルは、患者の治療を選択するための個別化された医療だけでなく、翻訳研究のための最も貴重なツールの一つです。PDXの主な用途には、バイオマーカーの発見と薬物検査が含まれます。PDXモデルは薬剤耐性メカニズムの研究や薬剤耐性34、35,35を克服するための戦略を特定するためにもうまく使用される。本稿に記載されているアプローチは、研究者がヒト腫瘍における潜在的な治療標的を同定し、最初に属的に特徴付けられた生着腫瘍を収容するマウスにおいて生体内の対応する薬物の有効性を評価することを可能にする。プロトコルは、腹腔,内に生着した卵巣腫瘍を使用するが、マウス2、3、123で成長するのに十分2に積極的なあらゆるタイプの腫瘍に適用可能である。12

Protocol

卵巣癌の同意された患者からの新鮮な組織は、メイヨークリニック機関審査委員会(IRB)によって承認されたプロトコルに従って、脱バルク手術の時点で収集されました。このプロトコルで使用されるすべての動物の手順と治療は、メイヨークリニックの施設動物ケアと使用委員会(IACUC)によって承認され、動物ケアガイドラインに従いました。 1. 合致ペアのシーケンシング?…

Representative Results

脱バルク手術時に切除された卵巣腫瘍からの組織をIRBガイダンスに従って採取し、1)遺伝子組み換えおよび2)免疫不全マウスにおける生着に使用した(図1)。Mateペアシーケンシングプロトコル36,37は36、損失、利益および増幅を含むDNAの構造的変化を同定するために使用された。1つの腫瘍におけるゲノム変化の風景を示す代表的?…

Discussion

我々は、検査のための最良の選択薬を決定するためにゲノムプロファイリングによって得られる腫瘍の分子特性を利用するPDXモデルで「臨床試験」を行うために使用したアプローチとプロトコルを説明する。現在、全ゲノムシーケンシング、RNAseq、カスタマイズされた遺伝子パネルを含む原発性腫瘍のゲノム特性解析には、複数のシーケンシングプラットフォームが使用されています。高品?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

メイヨークリニック個人医学センター(CIM)のリン・ヤン博士とフェイ・R・ハリスさん(MS)のメンバーに、実験の支援をいただきありがとうございます。この作品は、ニール・E・エックルズ夫妻のメイヨー個別医療センターへの贈り物によって支えられました。

Materials

3M Vetbond 3M, Co. 1469SB
anti-AKT antibody Cell Signaling Technologies, Inc. 9272
Anti-GAPDH antibody(G-9) Santa Cruz Biotech. Inc. sc-365062
Anti-MAPK antibody Cell Signaling Technologies, Inc. 9926
Anti-phospho-AKT antibody Cell Signaling Technologies, Inc. 9271
Anti-mTOR antibody Cell Signaling Technologies, Inc. 2972
Anti-Phospho-mTOR antibody Cell Signaling Technologies, Inc. 2971
Anti-Phospho-S6 antibody Cell Signaling Technologies, Inc. 4858
Anti-Rictor antibody Cell Signaling Technologies, Inc. 2114
Anti-S6 antibody Cell Signaling Technologies, Inc. 2217
Captisol ChemScene, Inc. cs-0731
Carboplatin NOVAPLUS, Inc. 61703-360-18
DMEM Mediatech, Inc. 10-013-CV
Easy-A Hi-Fi PCR Cloning Enzyme Agilent, Inc. 600404-51
Lubricant Cardinal Healthcare 82-280
Matrigel Corning, Inc. 356234
McCoy's media Mediatech, Inc. 10-050-CV
MK-2206 ApexBio, Inc. A3010
MK-8669 ARIAD Pharmaceuticals, Inc. AP23573
Nair Sensitive Skin Church & Dwight Co. Nair Hair Remover Shower Power Sensitive
NOD/SCID mice Charles River, Inc. NOD.CB17-Prkdcscid/NCrCrl
Paclitaxel NOVAPLUS, Inc. 55390-304-05
PEG400 Millipore Sigma, Inc. 88440-250ML-F
Perjeta Genetech, Co. Pertuzumab
Rituximab Genetech, Co. Rituxan
RPMI1640 Mediatech, Inc. 10-040-CV
SCID mice Harlan Laboratories, Inc. C.B.-17/IcrHsd-PrkdcscidLystbg
SLAx 13-6MHz linear transducer FUJIFILM SonoSite, Inc HFL38xp
SonoSite S-series Ultrasound machine FUJIFILM SonoSite, Inc SonoSite SII
Tween 80 Millipore Sigma, Inc. P4780-100ML
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Zhang, P., Kovtun, I. V. Testing Targeted Therapies in Cancer using Structural DNA Alteration Analysis and Patient-Derived Xenografts. J. Vis. Exp. (161), e60646, doi:10.3791/60646 (2020).
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