Test delle terapie mirate nel cancro utilizzando l'analisi dell'alterazione strutturale del DNA e gli Xenogrini derivati dal paziente
Summary
Qui presentiamo un protocollo per testare l’efficacia delle terapie mirate selezionate in base alla trucco genomico di un tumore. Il protocollo descrive l’identificazione e la convalida dei riarrangiamenti strutturali del DNA, l’innesto dei tumori dei pazienti nei topi e il test delle risposte ai farmaci corrispondenti.
Abstract
Vi presentiamo un approccio integrativo per testare l’efficacia delle terapie mirate che combina il sequenziamento tecnolo-gies di prossima generazione, le analisi terapeutiche degli obiettivi e il monitoraggio della risposta ai farmaci utilizzando xenografifti derivati dal paziente (PDX). Questa strategia è stata convalidata utilizzando tumori ovarici come esempio. Il protocollo di sequenziamento della coppia di accoppiamento di nuova generazione (MPseq) è stato utilizzato per identificare le alterazioni strutturali e seguito dall’analisi delle alterazioni potenzialmente indirizzabili. I tumori umani coltivati in topi immunocompromessi sono stati trattati con farmaci selezionati sulla base delle analisi genomiche. I risultati hanno dimostrato una buona correlazione tra le risposte previste e le risposte osservate nel modello PDX. L’approccio presentato può essere utilizzato per testare l’efficacia dei trattamenti combinati e aiutare il trattamento personalizzato per i pazienti con cancro ricorrente, in particolare nei casi in cui la terapia standard fallisce e c’è la necessità di utilizzare farmaci fuori etichetta.
Introduction
Gli xenografi (PDX) derivati dal paziente, generati dall’impianto di pezzi di tumore del paziente in topi immunodeficienti, sono emersi come un potente modello preclinico per aiutare la cura personalizzata anti-cancro. I modelli PDX sono stati sviluppati con successo per una varietà di neoplasie umane. Questi includono cancri al seno e alle ovaie, melanoma maligno, cancro colorettale, adenocarcinoma pancreatico e cancro del polmone non a piccole cellule1,2,2,4,5.5 Il tessuto tumorale può essere impiantato ortotopicamente o eterotopicamente. Il primo, considerato più preciso ma tecnicamente difficile, comporta il trapianto direttamente nell’organo di origine tumorale. Si ritiene che questi tipi di modelli imitano con precisione l’istologia del tumore originale a causa del microambiente “naturale” per il tumore6,7. Ad esempio, il trapianto ortotopico nella borsa dell’ovaio del topo ha portato alla diffusione del tumore nella cavità peritoneale e alla produzione di asciti, tipici del cancro ovarico8. Allo stesso modo, l’iniezione di tumori al seno nel toracico invece della ghiandola mammaria addominale ha influenzato il tasso di successo e il comportamento della PDX9. Tuttavia, i modelli ortotopici richiedono sofisticati sistemi di imaging per monitorare la crescita del tumore. L’impianto eterotopico del tumore solido viene in genere eseguito impiantando tessuto nel fianco sottocutaneo di un topo che consente un monitoraggio più facile della crescita del tumore ed è meno costoso e richiede tempo7. Tuttavia, i tumori cresciuti sottocutaneamente raramente metastatizzano a differenza di quanto osservato nel caso dell’impianto ortotopico10.
Il tasso di successo di innesto ha dimostrato di variare e dipendono notevolmente dal tipo di tumore. Tumori più aggressivi e campioni di tessuto contenenti una percentuale più alta di cellule tumorali sono stati segnalati per avere migliori tassi di successo12,13. Coerentemente con questo, i tumori derivati da siti metastatici hanno dimostrato di innestare a frequenze del 50-80%, mentre quelli dei siti primari innevano frequenze fino al 14%12. Al contrario, tessuto contenente cellule necrotiche e meno cellule tumorali vitali innevamale male. La crescita del tumore può anche essere promossa dall’aggiunta di proteine della matrice della membrana seminterrato nel mix di tessuto al momento dell’iniezione nei topi14 senza compromettere le proprietà del tumore originale. Le dimensioni e il numero di pezzi di tessuto destinati all’impianto sono stati trovati anche per influenzare il tasso di successo dell’innesto. Sono stati segnalati maggiori consumi tumorali per l’impianto nella capsula sub-renale rispetto all’impianto sottocutaneo dovuto alla capacità della capsula sub-renale di mantenere lo stroma tumorale originale e fornire anche le cellule stromali ospiti15.
La maggior parte degli studi utilizza topi immunodeficienti NOD/SCID, che mancano di cellule killer naturali16 e hanno dimostrato di aumentare l’innesto tumorale, la crescita e la metastasi rispetto ad altri ceppi14. Tuttavia, è necessario un ulteriore monitoraggio in quanto possono sviluppare linfomi timici già a 3-4 mesi di età13. Nei trapianti di tumore ovarico coltivati in topi SCID, la disoccupazione delle cellule B è stata inibita con successo da rituximab, impedendo lo sviluppo di linfomi ma senza influenzare l’innesto dei tumori ovarici17.
Più recentemente, NSG (NOD. Cg-Prkdcha scritto il 2rg Il2rgTm1Wjl/SzJ) topi, portando una mutazione nulla nel gene che codifica la catena gamma del recettore interleucolo 218,è diventato un ceppo frequentemente utilizzato per la generazione di modelli PDX. I tumori da modelli PDX consolidati passaggiano alle generazioni future di topi sono segnalati per mantenere le proprietà istologiche e molecolari per 3 a 6 generazioni19,20. Numerosi studi hanno dimostrato che gli esiti del trattamento nei modelli PDX imitano quelli dei loro pazienti corrispondenti2,3,4,21,22,23.23 Il tasso di risposta alla chemioterapia nei modelli PDX per il cancro del polmone non piccolo e carcinomi colorettali era simile a quello degli studi clinici per gli stessi farmaci24,25. Studi condotti in modelli PDX, sviluppati per pazienti arruolati in studi clinici, hanno dimostrato risposte a farmaci testati simili a quelli osservati clinicamente nei pazienti corrispondenti2,3,4.
Le analisi genomiche ad alto valore di throughput di un tumore del paziente in combinazione con i modelli PDX forniscono un potente strumento per studiare le correlazioni tra specifiche alterazioni genomiche e una risposta terapeutica. Queste sono state descritte in alcune pubblicazioni26,27. Ad esempio, le risposte terapeutiche all’inibitore EGFR cetuximab in una serie di modelli pdX colorettale che trasportano amplificazione EGFR, hanno parallelo le risposte cliniche acetuximab nei pazienti28.
Ci sono alcune sfide associate allo sviluppo e all’applicazione di modelli PDX. Tra questi c’è l’eterogeneità tumorale29,30 che può compromettere l’accuratezza dell’interpretazione della risposta al trattamento come un clone a cella singola con maggiore capacità proliferviva all’interno di una PDX può superare gli altri31, con conseguente perdita di eterogeneità. Inoltre, quando vengono utilizzate biopsie a singolo tumore per sviluppare la PDX, alcune delle popolazioni cellulari potrebbero essere perse e non saranno rappresentate nell’innesto finale. Più campioni dello stesso tumore sono raccomandati per l’impianto per risolvere questo problema. Anche se i tumori PDX tendono a contenere tutti i tipi di cellule del tumore donatore originale, queste cellule vengono gradualmente sostituite da quelle di origine murina3. L’interazione tra murine stroma e cellule tumorali umane nei modelli PDX non è ben compresa. Tuttavia, le cellule stromali hanno dimostrato di ricapitolare il microambiente tumorale33.
Nonostante queste limitazioni, i modelli PDX rimangono tra gli strumenti più preziosi per la ricerca traslazionale e la medicina personalizzata per la selezione delle terapie per i pazienti. Le principali applicazioni dei PDX includono la scoperta di biomarcatori e i test antidroga. I modelli PDX sono utilizzati con successo anche per studiare i meccanismi di resistenza ai farmaci e identificare le strategie per superare la resistenza ai farmaci34,35. L’approccio descritto nel presente manoscritto consente al ricercatore di identificare potenziali bersagli terapeutici nei tumori umani e di valutare l’efficacia dei farmaci corrispondenti invivo, nei topi che ospitano tumori innestati inizialmente caratterizzati genomicamente. Il protocollo utilizza tumori ovarici engrafted intraperitoneally ma è applicabile a qualsiasi tipo di tumore sufficientemente aggressivo per crescere nei topi2,3,12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Descriviamo l’approccio e i protocolli che abbiamo usato per condurre una “sperimentazione clinica” nei modelli PDX che sfrutta le caratteristiche molecolari del tumore ottenute dalla profilazione genomica per determinare la migliore scelta di farmaci per il test. Più piattaforme di sequenziamento sono attualmente utilizzate per la caratterizzazione genomica dei tumori primari, tra cui il sequenziamento dell’intero genoma, gli RNA aseq e i pannelli genici personalizzati. Per il carcinoma ovarico siero di alta qualità, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo i membri del Mayo Clinic Center for Individualized Medicine (CIM) Dr. Lin Yang e Faye R. Harris, MS, per l’aiuto nello svolgimento di esperimenti. Questo lavoro è stato sostenuto da Don.
Materials
| 3M Vetbond | 3M, Co. | 1469SB | |
| anti-AKT antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 9272 | |
| Anti-GAPDH antibody(G-9) | Santa Cruz Biotech. Inc. | sc-365062 | |
| Anti-MAPK antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 9926 | |
| Anti-phospho-AKT antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 9271 | |
| Anti-mTOR antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 2972 | |
| Anti-Phospho-mTOR antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 2971 | |
| Anti-Phospho-S6 antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 4858 | |
| Anti-Rictor antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 2114 | |
| Anti-S6 antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 2217 | |
| Captisol | ChemScene, Inc. | cs-0731 | |
| Carboplatin | NOVAPLUS, Inc. | 61703-360-18 | |
| DMEM | Mediatech, Inc. | 10-013-CV | |
| Easy-A Hi-Fi PCR Cloning Enzyme | Agilent, Inc. | 600404-51 | |
| Lubricant | Cardinal Healthcare | 82-280 | |
| Matrigel | Corning, Inc. | 356234 | |
| McCoy's media | Mediatech, Inc. | 10-050-CV | |
| MK-2206 | ApexBio, Inc. | A3010 | |
| MK-8669 | ARIAD Pharmaceuticals, Inc. | AP23573 | |
| Nair Sensitive Skin | Church & Dwight Co. | Nair Hair Remover Shower Power Sensitive | |
| NOD/SCID mice | Charles River, Inc. | NOD.CB17-Prkdcscid/NCrCrl | |
| Paclitaxel | NOVAPLUS, Inc. | 55390-304-05 | |
| PEG400 | Millipore Sigma, Inc. | 88440-250ML-F | |
| Perjeta | Genetech, Co. | Pertuzumab | |
| Rituximab | Genetech, Co. | Rituxan | |
| RPMI1640 | Mediatech, Inc. | 10-040-CV | |
| SCID mice | Harlan Laboratories, Inc. | C.B.-17/IcrHsd-PrkdcscidLystbg | |
| SLAx 13-6MHz linear transducer | FUJIFILM SonoSite, Inc | HFL38xp | |
| SonoSite S-series Ultrasound machine | FUJIFILM SonoSite, Inc | SonoSite SII | |
| Tween 80 | Millipore Sigma, Inc. | P4780-100ML |
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