Desarrollamos un ensayo de citometría de flujo simple para evaluar la unión de los anticuerpos de bloqueo de PD-1 a los células T, que requieren sólo una gota de sangre periférica de los pacientes con cáncer.
Los inhibidores del punto de control inmune, incluidos los anticuerpos que bloquean la DP-1, han mejorado significativamente los resultados del tratamiento en varios tipos de cáncer. La eficacia farmacológica de estas inmunoterapias es de larga duración, extendiéndose incluso más allá de la interrupción de sus inyecciones, debido a las concentraciones persistentes de sangre. Aquí desarrollamos un ensayo de citometría de flujo simple para evaluar el estado de unión a las células T de los anticuerpos de bloqueo de PD-1 nivolumab y pembrolizumab. Al igual que una prueba de glucosa, este ensayo requiere una sola gota de sangre periférica. Visualizar la unión de anticuerpos en los células T es más fiable que medir las concentraciones de anticuerpos en la sangre. Además, si es necesario, podemos analizar potencialmente muchos marcadores distintivos relacionados con el sistema inmunitario en células T enlazadas a anticuerpos de bloqueo PD-1. Por lo tanto, se trata de una estrategia simple y mínimamente invasiva para analizar el efecto farmacológico de los anticuerpos de bloqueo de PD-1 en pacientes con cáncer.
Los anticuerpos de bloqueo de PD-1 se han convertido en la opción estándar para el tratamiento de varios tipos de cáncer, incluido el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC)1,2,3,4. Muestran un efecto terapéutico notable en un subconjunto de pacientes con cáncer que no han respondido a las quimioterapias citotóxicas convencionales. Sin embargo, los inhibidores del punto de control inmune (IIC), que incluyen anticuerpos de bloqueo de PD-1, pueden causar un espectro único y distinto de eventos adversos, llamados eventos adversos relacionados con el sistema inmunitario (irAE)5. Aunque las irAEs pueden afectar casi todos los tejidos, se observan más comúnmente en el tracto gastrointestinal, glándulas endocrinas, piel, y el hígado, y pueden causar prurito, erupción cutánea, náuseas, diarrea, y trastornos de la tiroides6,7. En general, la mayoría de las iAE aparecen entre 1 y 2 meses después del inicio de las IIC. Sin embargo, en algunos casos, pueden ocurrir más tarde de 1 año después del inicio del tratamiento o incluso después de la interrupción del tratamiento6,7. También causan varios síntomas que pueden ser difíciles de discriminar de otras patologías. Por lo tanto, puede ser difícil diagnosticar rápidamente irAEs y tratarlos adecuadamente. irAE puede afectar a todos los tejidos, y su aparición está fuertemente influenciada por las células inmunitarias circulantes, especialmente las células T unidas a los anticuerpos de bloqueo de PD-1. Por lo tanto, un método sencillo y mínimamente invasivo para monitorear las células T dirigidas a anticuerpos es importante en entornos clínicos.
Aquí, desarrollamos un método sencillo para evaluar la unión de los anticuerpos pd-1, bloqueando los anticuerpos a las células T utilizando una gota de sangre entera periférica de pacientes con cáncer que recibieron nivolumab o pembrolizumab. Utilizando este enfoque, pudimos monitorear cada uno de los siguientes: 1) la duración de la unión de anticuerpos a las células T, 2) la ocupación de las moléculas DE PD-1 de células T por anticuerpos terapéuticos, y 3) el estado de activación y las características inmunológicas de los células T. Este método es una modificación de una técnica notificada previamente8. La cantidad de sangre requerida es casi la misma que la necesaria para una prueba de glucosa, y el enfoque no requiere enriquecimiento de células mononucleares o co-cultivo con anticuerpos de bloqueo de PD-1. Confirmamos que este método también se puede realizar utilizando muestras congeladas, incluyendo células mononucleares de sangre periférica (PPBM) y células de derrame pleural, derrame pericárdico, líquido de lavado broncoalveolar, y líquido cefalorraquídeo, lo que sugiere que esta estrategia puede ser útil en el contexto de un estudio multicéntrico. Este método puede facilitar el diagnóstico precoz de irAEs, y también ayudar a determinar los tratamientos inmunosupresores adecuados para controlar sus síntomas e identificar los tiempos óptimos para iniciar terapias posteriores después de los inhibidores de la PD-1.
En este artículo, informamos de un método utilizando un citómetro de flujo para detectar anticuerpos de bloqueo PD-1 unidos a células T derivados de una gota de sangre periférica, que originalmente desarrollamos para la detección de nivolumab10. Aunque esta técnica es muy simple y fácil de realizar, se deben observar dos puntos importantes para obtener resultados precisos. Una es que para detectar moléculas de PD-1, se debe utilizar un anticuerpo adecuado que compita con nivolumab y pembr…
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue apoyado por subvenciones a S.K. de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia KAKENHI (JP17K16045) y la Agencia Japonesa de Investigación y Desarrollo Médico (JP18cm0106335 y 19cm0106310).
10X RBC Lysis Buffer (Multi-species) | Thermo Fisher Scientific | 00-4300-54 | 50 mL |
APC/Cyanine7 anti-human CD4 Antibody | BioLegend | 300518 | Clone RPA-T4 |
BD FACS Canto II Flow Cytometer | BD | ||
Brilliant Violet 510 anti-human CD8a Antibody | BioLegend | 301048 | Clone RPA-T8 |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | nacalai tesque | 14249-95 | 500 mL |
Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes | STEMCELL Technologies | 352058 | 5 mL |
FcR Blocking Reagent, human | Miltenyi Biotec | 130-059-901 | 2 mL |
FLOWJO | BD | ||
Gibco Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 12676029 | 500 mL |
Mouse IgG1 monoclonal – Isotype control | abcam | ab81200 | |
Mouse monoclonal Anti-Human IgG4 Fc | abcam | ab99825 | Clone HP6025 |
Pacific Blue Mouse Anti-Human CD3 | BD | 558117 | Clone UCHT1 |
PE-Cy7 Mouse anti-Human CD279 (PD-1) | BD | 561272 | Clone EH12.1 |
PE-Cy7 Mouse IgG1 κ Isotype Control | BD | 557646 |