Surveillance des anticorps PD-1-Blocking liés aux lymphocytes T dérivés d'une goutte de sang périphérique

Summary

Nous avons développé un essai simple de cytométrie de flux pour évaluer la liaison des anticorps de PD-1-bloquant aux cellules De, exigeant seulement une goutte de sang périphérique des patients cancéreux.

Abstract

Les inhibiteurs du point de contrôle immunitaire, y compris les anticorps de blocage de la DP-1, ont considérablement amélioré les résultats du traitement dans divers types de cancer. L’efficacité pharmacologique de ces immunothérapies est durable, s’étendant même au-delà de l’arrêt de leurs injections, en raison des concentrations persistantes de sang. Ici, nous avons développé un essai de cytométrie de flux simple pour évaluer l’état de liaison des lymphocytes T des anticorps PD-1-bloquant nivolumab et pembrolizumab. Comme un test de glucose, cet essai ne nécessite qu’une seule goutte de sang périphérique. La visualisation de la liaison des anticorps sur les lymphocytes T est plus fiable que la mesure des concentrations sanguines d’anticorps. En outre, si nécessaire, nous pouvons potentiellement analyser de nombreux marqueurs distinctifs liés au système immunitaire sur les lymphocytes T liés aux anticorps PD-1-bloquant. Ainsi, il s’agit d’une stratégie simple et mini-invasive pour analyser l’effet pharmacologique des anticorps de Blocage de PD-1-blocage dans les patients cancéreux.

Introduction

Les anticorps de blocage de PD-1 sont devenus le choix standard pour le traitement de divers types de cancer, y compris le cancer du poumon de non-petite cellule (NSCLC)^1,2,3,4. Ils montrent un effet thérapeutique remarquable dans un sous-ensemble de patients cancéreux qui n’ont pas répondu aux chimiothérapies cytotoxiques conventionnelles. Cependant, les inhibiteurs du point de contrôle immunitaire (IIC), qui comprennent les anticorps de blocage de la DP-1, peuvent causer un spectre unique et distinct d’événements indésirables, appelés événements indésirables liés au système immunitaire (IRAE)⁵. Bien que les irAE peuvent affecter presque tous les tissus, ils sont le plus souvent observés dans le tractus gastro-intestinal, les glandes endocrines, la peau et le foie, et ils peuvent causer le prurit, éruption cutanée, nausées, diarrhée, et troubles thyroïdiens^6,7. En général, la plupart des irAE apparaissent dans les 1 à 2 mois suivant le déclenchement des ICI. Cependant, dans certains cas, ils peuvent se produire plus tard que 1 an après le début du traitement ou même après l’arrêt du traitement^6,7. Ils causent également divers symptômes qui peuvent être difficiles à distinguer d’autres pathologies. Ainsi, il peut être difficile de diagnostiquer rapidement irAEs et de les traiter de façon appropriée. irAEs peut affecter tous les tissus, et leur arrivée est fortement influencée par la circulation des cellules immunitaires, en particulier les lymphocytes T liés aux anticorps PD-1-blocage. Par conséquent, une méthode simple et mini-invasive pour surveiller les lymphocytes T ciblés par les anticorps est importante dans les milieux cliniques.

Ici, nous avons développé une méthode simple pour évaluer la liaison des anticorps de PD-1-bloquant aux cellules T utilisant une goutte de sang entier périphérique des patients de cancer qui ont reçu le nivolumab ou le pembrolizumab. En utilisant cette approche, nous avons pu surveiller chacun des éléments suivants : 1) la durée de la liaison des anticorps aux lymphocytes T, 2) l’occupation des molécules De Lymph PD-1 par des anticorps thérapeutiques, et 3) l’état d’activation et les caractéristiques immunologiques des lymphocytes T. Cette méthode est une modification d’une technique précédemment rapportée⁸. La quantité de sang nécessaire est presque la même que celle nécessaire pour un test de glucose, et l’approche ne nécessite pas d’enrichissement cellulaire mononucléaire ou de co-culture avec des anticorps PD-1-blocage. Nous avons confirmé que cette méthode peut également être effectuée à l’aide d’échantillons congelés, y compris les cellules mononucléaires sanguines périphériques (PBMC) et les cellules de l’effusion pleurale, l’effusion péricardique, le liquide de lavage bronchoalveolar, et le liquide céphalo-rachidien, suggérant que cette stratégie puisse être utile dans le contexte d’une étude multicentrique. Cette méthode peut faciliter le diagnostic précoce des irAE, et également aider à déterminer les traitements immunosuppresseurs appropriés pour contrôler leurs symptômes et d’identifier les moments optimaux pour initier des thérapies ultérieures après inhibiteurs de PD-1.

Protocol

L’échantillonnage a été effectué pendant les procédures cliniques courantes. Tous les échantillons humains ont été obtenus après que le consentement éclairé a été fourni par les sujets, conformément à la Déclaration d’Helsinki et avec l’approbation du comité d’examen éthique de l’École supérieure de médecine de l’Université d’Osaka, au Japon (15383 et 752). 1. Préparation d’échantillons de sang entier et coloration Recueillir des échantillons de sang entier d…

Representative Results

La stratégie de gating et l’analyse de cytométrie de flux (figure 1) peuvent détecter la liaison d’anticorps de PD-1-bloquant aux cellules T obtenues à partir d’une goutte de sang périphérique patient de NSCLC. Avant l’administration de l’anticorps PD-1-bloquant, il n’y a pas de cellules CD8 ou CD4 positives humaines, et l’expression PD-1 peut être confirmée par un anticorps de détection de PD-1 (EH12.1)(figure 2A). Après l’administrat…

Discussion

Dans cet article, nous rapportons une méthode utilisant un cytomètre de flux pour détecter les anticorps de PD-1-bloquant lié aux cellules T dérivées d’une goutte de sang périphérique, que nous avons à l’origine développé pour la détection de nivolumab¹⁰. Bien que cette technique soit très simple et facile à exécuter, deux points importants doivent être notés afin d’obtenir des résultats précis. La première est que pour détecter les molécules de PD-1, un anticorps approprié …

Materials

10X RBC Lysis Buffer (Multi-species)	Thermo Fisher Scientific	00-4300-54	50 mL
APC/Cyanine7 anti-human CD4 Antibody	BioLegend	300518	Clone RPA-T4
BD FACS Canto II Flow Cytometer	BD
Brilliant Violet 510 anti-human CD8a Antibody	BioLegend	301048	Clone RPA-T8
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	nacalai tesque	14249-95	500 mL
Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes	STEMCELL Technologies	352058	5 mL
FcR Blocking Reagent, human	Miltenyi Biotec	130-059-901	2 mL
FLOWJO	BD
Gibco Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	12676029	500 mL
Mouse IgG1 monoclonal – Isotype control	abcam	ab81200
Mouse monoclonal Anti-Human IgG4 Fc	abcam	ab99825	Clone HP6025
Pacific Blue Mouse Anti-Human CD3	BD	558117	Clone UCHT1
PE-Cy7 Mouse anti-Human CD279 (PD-1)	BD	561272	Clone EH12.1
PE-Cy7 Mouse IgG1 κ Isotype Control	BD	557646