Для выявления новых регуляторов транскрипционных факторов, мы разработали подход к экрану массивных лентивирных или ретровирусных рнки библиотек с помощью двойной люциферазы основе транскрипционного репортера ассс. Такой подход предлагает быстрый и относительно недорогой способ проверки сотен кандидатов в одном эксперименте.
Транскрипционные факторы могут изменить экспрессию многочисленных генов-мишеней, которые влияют на различные процессы вниз по течению, что делает их хорошими мишенями для противораковой терапии. Однако, непосредственно ориентации транскрипционных факторов часто трудно и может вызвать неблагоприятные побочные эффекты, если транскрипционный фактор необходим в одной или нескольких взрослых тканей. Выявление восходящих регуляторов, которые аберантно активируют транскрипционные факторы в раковых клетках, предлагает более осуществимую альтернативу, особенно если эти белки легко смягчены. Здесь мы описываем протокол, который может быть использован для объединения массивных среднесрочных лентивирных библиотек и двухлюциферазы основе транскрипционного репортера асссы для выявления новых регуляторов транскрипционных факторов в раковых клетках. Наш подход предлагает быстрый, простой и недорогой способ тестирования сотен генов в одном эксперименте. Чтобы продемонстрировать использование этого подхода, мы выполнили экран массивной лентивирусной библиотеки РНК, содержащей несколько регуляторов ассоциированного белка Yes (YAP) и транскрипционного со-активатора с pd’-связывающим мотивом (ТАЗ), двумя транскрипционными коактиваторами, которые являются эффекторами вниз по течению пути Гиппо. Однако этот подход можно было бы изменить для проверки для регуляторов практически любого фактора транскрипции или со-фактора, а также можно было бы использовать для проверки библиотек CRISPR/CAS9, cDNA или ORF.
Цель этого ассеса заключается в использовании вирусных библиотек для выявления регуляторов транскрипционных факторов относительно быстрым и недорогим способом. Аномальная транскрипционная активность связана с раком и метастазами1,,2,,3,,44,5,,6,поэтому таргетинг факторов транскрипции в раковых клетках является перспективным терапевтическим подходом. Тем не менее, транскрипционные факторы часто трудно ориентировать фармакологически7, и многие из них необходимы для нормальной клеточной функции во взрослых тканях88,9,,10. Ориентация на рак связанных путей, которые аберрантно активировать транскрипционные факторы для привода болезни является более осуществимым подходом с потенциалом иметь менее серьезные побочные эффекты. Коммерческая доступность массивных лентивирных и ретровирусных рнквирных РНК, CRISPR/CAS9, cDNA или ORF библиотек позволяет исследователям проверить важность многочисленных генов в одном эксперименте. Тем не менее, требуется надежное считывание для измененной транскрипционной активности.
Здесь мы описываем использование двойной люциферазы основе транскрипционного репортера анализ и массивные лентивирные библиотеки для выявления белков, которые регулируют транскрипционные факторы в раковых клетках. В этом исследовании, shRNAs, которые нацелены на рак связанных генов поставляются в клетки рака млекопитающих через лентивирусной трансдукции и клетки выбираются для стабильной интеграции с использованием пуромицина. Клетки следующий трансфицируется с репортером построить, что выражает светлячок luciferase управляется промоутер омрачается промоутер конкретных транскрипции фактор, который исследуется и контрольная конструкция, которая выражает Ренилья luciferase от constitutively активный промоутер, который не реагирует на транскрипции фактор исследуется. Мы демонстрируем этот подход с экраном доказательства концепции для регуляторов YAP и ТАЗ, критических эффекторов вниз по течению пути Гиппо8,10,11. Аномальная активность ЯП и ТАЗ способствует нескольким шагам метастатического каскада11 и наблюдается у многих видов рака11,,12,,13. Однако, как YAP и ТАЗ становятся аберантно активированы в некоторых раковых клетках еще не полностью понял. YAP и ТАЗ не связывают ДНК, но вместо этого набираются в промоутеров другими факторами транскрипции. Члены семейства факторов транскрипции TEA (TEAD) являются основными обязательными партнерами для YAP и ТАЗ, и имеют решающее значение для большинства функций, зависящих от YAP и ТАЗ. Наш репортер конструирует светлячок luciferase от YAP/ТАЗ-TEAD-реакционный промоутер и предыдущие изучения показали что оно верно обнаруживает изменения в YAP-TEAD и транскрипционной деятельности TA’-TEAD2,14,15.
Наш подход является быстрым, средней пропускной способностью и не требует скрининга, автоматизированных роботов или глубокого секвенирования объединенных библиотек. Затраты являются относительно низкими, и есть множество коммерчески доступных библиотек на выбор. Необходимое оборудование и реагенты также являются относительно стандартными в большинстве лабораторий. Он может быть использован для проверки для регуляторов практически любого фактора транскрипции, если luciferase основе репортер существует или генерируется. Мы используем этот подход для скрининга shRNAs в раковых клетках, но любая клеточная линия, которая может быть трансфицирована с разумной эффективностью, может быть использована с любым типом массивной библиотеки.
В этом исследовании мы демонстрируем подход к скринингу средней пропускной связи массивных вирусных библиотек в сочетании с анализом транскрипционного репортера на основе двойной люциферазы, который может быть использован для выявления и тестирования новых регуляторов транскрипци?…
The authors have nothing to disclose.
Мы хотели бы поблагодарить Эмили Нортон и Микаэлан Куччарре-Стулигсу за помощь в подготовке векторов шРНК. Эта работа была частично поддержана Сьюзен Г. Komen Карьера Катализатор Грант, который присуждается JML (#CCR17477184).
2.0 ml 96-well deep well polypropylene plate | USA Scientific | 1896-2000 | For bacterial mini-prep |
Trypsin – 2.50% | Gibco | 15090-046 | Component of trypsin-EDTA |
96 well flat bottom white assay plate | Corning | 3922 | For dual-luciferase assay |
Ampicillin – 100 mg/ml | Sigma-Aldrich | 45-10835242001-EA | For bacterial mini-prep |
Bacto-tryptone – powder | Sigma-Aldrich | 95039 | Component of LB broth |
Dual-luciferase reporter assay system, which include LAR II reagent (reagent A), Stop & Glo substrate (reagent B substrate) and Stop & Glo buffer (reagent B buffer) – Kit | Promega | E1960 | For dual-luciferase assay |
Dulbecco's phosphate buffered saline w/o calcium, magnesium and phenol red – 9.6 g/L | Himedia | TS1006 | For PBS |
EDTA – 0.5 M | VWR | 97061-406 | Component of trypsin-EDTA |
Ethanol – 100% | Pharmco-AAPER | 111000200 | For bacterial mini-prep |
Foetal Bovine Serum – 100% | VWR | 97068-085 | Component of complete growth media |
Hexadimethrine bromide (Polybrene) – 8 mg/ml | Sigma-Aldrich | 45-H9268 | For virus infection |
HyClone DMEM/High glucose – 4 mM L-Glutamine; 4500 mg/L glucose; sodium pyruvate | GE Healthcare life sciences | SH30243.01 | Component of complete growth media |
I3-P/i3 Multi-Mode Microplate/EA | Molecular devices | For dual-luciferase assay | |
L-Glutamine – 200 mM | Gibco | 25030-081 | Component of complete growth media |
Lipofectamine 3000 (Transfection Reagent 2) – 100% | Life technologies | L3000008 | For transfections |
Molecular Biology Water – 100% | VWR | 02-0201-0500 | For dilution of shRNA vector for virus packaging |
NaCl – powder | BDH | BDH9286 | Component of LB broth |
NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo scientific | For measuring vector DNA concentration | |
Opti-MEM (Transfection Buffer) – 100% | Gibco | 31985-062 | For transfections |
Penicillin Streptomycin – 10,000 Unit/ml (Penicillin); 10,000 µg/ml (Streptomycin) | Gibco | 15140-122 | Component of complete growth media |
PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit – Kit | Thermo Fisher Scientific | K210010 | For bacterial mini-prep |
Puromycin – 2.5 mg/ml | Sigma-Aldrich | 45-P7255 | For antibiotic selection after infection |
TC20 automated cell counter | Bio-Rad | For cell counting | |
X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent (Transfection Reagent 1) – 100% | Roche | 6365787001 | For virus packaging |
Yeast extract – powder | VWR | J850 | Component of LB broth |
P3000 (Transfection Reagent 3) – 100% | Life technologies | L3000008 | For transfections |