転写因子の新しい調節因子を同定するために、我々は、二重ルシメラーゼベースの転写レポーターアッセイを用いて、配列レンチウイルスまたはレトロウイルスRNAiライブラリをスクリーニングするアプローチを開発した。このアプローチは、1回の実験で数百人の候補者をスクリーニングするための迅速かつ比較的安価な方法を提供します。
転写因子は、さまざまな下流プロセスに影響を与える多数の標的遺伝子の発現を変化させ、抗癌療法の良い標的となる可能性があります。しかし、転写因子を直接標的化することはしばしば困難であり、転写因子が1つ以上の成人組織で必要な場合には副作用を引き起こす可能性がある。がん細胞の転写因子を異常に活性化する上流の調節因子を特定することは、特にこれらのタンパク質が薬物に対して容易である場合、より実現可能な代替手段を提供する。ここでは、配列中規模レンチウイルスライブラリーと、がん細胞における転写因子の新しい調節因子を同定するための二重ルシファーゼベースの転写レポーターアッセイを組み合わせることができるプロトコルについて説明する。当社のアプローチは、1回の実験で何百もの遺伝子をテストするための迅速で簡単で安価な方法を提供します。このアプローチの使用を実証するために、カバ経路の下流のエフェクターである2つの転写共活性化剤であるYes-関連タンパク質(YAP)およびPDZ結合モチーフ(TAZ)と転写共活性化剤のいくつかの調節因子を含む配列レンチウイルスRNAiライブラリのスクリーンを行った。しかし、このアプローチは、実質的に任意の転写因子または共因子のレギュレータをスクリーニングするように変更することができ、CRISPR /CAS9、cDNA、またはORFライブラリをスクリーニングするためにも使用できます。
このアッセイの目的は、ウイルスライブラリーを使用して、比較的迅速かつ安価な方法で転写因子の調節因子を同定することにある。異常な転写活性は癌と,転移1、2、3、4、5、62,3に関連しているので、癌細胞における転写因子を標的化することは有望な治療アプローチである。1,4,56しかし、転写因子は、多くの場合、薬理学的に標的化することは困難である7、多くは、成体組織8、9、109,10の正常な細胞機能に必要とされる。8異常に転写因子を活性化して病気を引き起こす癌関連経路を標的にすることは、より重篤な副作用を有する可能性を有するより実現可能なアプローチである。配列レンチウイルスおよびレトロウイルスRNAi、CRISPR/CAS9、cDNA、またはORFライブラリの商業的利用により、研究者は単一の実験で多数の遺伝子の重要性をテストすることができます。しかし、転写活性の変化に対する信頼性の高い読み出しが必要です。
ここでは、がん細胞の転写因子を調節するタンパク質を同定するための、二重ルシメラーゼベースの転写レポーターアッセイおよびアレイ化レンチウイルスライブラリーの使用について述べた。本アッセイでは、がん関連遺伝子を標的とするshRNAがレンチウイルス導入を介して哺乳動物癌細胞に送達され、細胞はプロマイシンを用いて安定な集積のために選択される。細胞は、次に、調査中の転写因子に特異的なプロモーターによって駆動されるホタルルシメラーゼを発現するレポーター構築物と、調査中の転写因子に反応しない構成的に活性なプロモーターからレニラルシメラーゼを発現する対照構造を発現させるレポーター構築物にトランスフェクトされる。我々は、YAPおよびTAZの調節因子,、カバ経路8、10、1110の重要な下流エフェクターのための概8念実証画面でこのアプローチを実証する。11YAPおよびTAZの異常な活性は、転移性カスケード11のいくつかのステップを促進し、多くの癌11、12、1312,13で観察される。11しかし、いくつかの癌細胞においてYAPおよびTAZがどのように異常に活性化されるのかはまだ完全には理解されていない。YAPとTAZはDNAを結合せず、代わりに他の転写因子によってプロモーターにリクルートされる。転写因子のTEAドメイン(TEAD)ファミリーのメンバーは、YAPおよびTAZの主要な結合パートナーであり、ほとんどのYAPおよびTAZ依存的な機能にとって重要である。我々のレポーター構築物は、YAP/TAZ-TEAD応答性プロモーターからのホタルルシメラーゼを発現しており、以前の研究では、YAP-TEADおよびTAZ-TEAD転写活性22、14、1514,15の変化を忠実に検出することを実証した。
当社のアプローチは、高速で中規模のスループットであり、スクリーニング施設、自動ロボット、またはプールされたライブラリの深いシーケンスを必要としません。コストは比較的低く、選択する多くの市販のライブラリがあります。必要な装置および試薬はほとんどの実験室で比較的標準的である。ルシファーゼベースのレポーターが存在するか、生成された場合、事実上任意の転写因子の調節因子をスクリーニングするために使用することができます。このアプローチを使用してがん細胞のshRNAをスクリーニングしますが、合理的な効率でトランスフェクトできる細胞株は、あらゆるタイプのアレイ化されたライブラリで使用できます。
本研究では、転写因子の新規調節因子を同定し、試験するために使用できるデュアルルシファーゼベースの転写レポーターアッセイと組み合わせて、アレイドウイルスライブラリの中スループットスクリーニングのアプローチを実証する。どの画面の前にも、各セル行に対してレポーター システムを特徴付けて最適化することが重要です。調査対象の転写因子の活動の変化にレポーターが反…
The authors have nothing to disclose.
エミリー・ノートンとミカエラン・クッチャレ・ストゥリグロスがshRNAベクターの調製を支援してくれたことに感謝します。この作品の一部は、J.M.L.(#CCR17477184)に授与されたスーザン・G・コーメンキャリア触媒助成金によって支えられました。
2.0 ml 96-well deep well polypropylene plate | USA Scientific | 1896-2000 | For bacterial mini-prep |
Trypsin – 2.50% | Gibco | 15090-046 | Component of trypsin-EDTA |
96 well flat bottom white assay plate | Corning | 3922 | For dual-luciferase assay |
Ampicillin – 100 mg/ml | Sigma-Aldrich | 45-10835242001-EA | For bacterial mini-prep |
Bacto-tryptone – powder | Sigma-Aldrich | 95039 | Component of LB broth |
Dual-luciferase reporter assay system, which include LAR II reagent (reagent A), Stop & Glo substrate (reagent B substrate) and Stop & Glo buffer (reagent B buffer) – Kit | Promega | E1960 | For dual-luciferase assay |
Dulbecco's phosphate buffered saline w/o calcium, magnesium and phenol red – 9.6 g/L | Himedia | TS1006 | For PBS |
EDTA – 0.5 M | VWR | 97061-406 | Component of trypsin-EDTA |
Ethanol – 100% | Pharmco-AAPER | 111000200 | For bacterial mini-prep |
Foetal Bovine Serum – 100% | VWR | 97068-085 | Component of complete growth media |
Hexadimethrine bromide (Polybrene) – 8 mg/ml | Sigma-Aldrich | 45-H9268 | For virus infection |
HyClone DMEM/High glucose – 4 mM L-Glutamine; 4500 mg/L glucose; sodium pyruvate | GE Healthcare life sciences | SH30243.01 | Component of complete growth media |
I3-P/i3 Multi-Mode Microplate/EA | Molecular devices | For dual-luciferase assay | |
L-Glutamine – 200 mM | Gibco | 25030-081 | Component of complete growth media |
Lipofectamine 3000 (Transfection Reagent 2) – 100% | Life technologies | L3000008 | For transfections |
Molecular Biology Water – 100% | VWR | 02-0201-0500 | For dilution of shRNA vector for virus packaging |
NaCl – powder | BDH | BDH9286 | Component of LB broth |
NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo scientific | For measuring vector DNA concentration | |
Opti-MEM (Transfection Buffer) – 100% | Gibco | 31985-062 | For transfections |
Penicillin Streptomycin – 10,000 Unit/ml (Penicillin); 10,000 µg/ml (Streptomycin) | Gibco | 15140-122 | Component of complete growth media |
PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit – Kit | Thermo Fisher Scientific | K210010 | For bacterial mini-prep |
Puromycin – 2.5 mg/ml | Sigma-Aldrich | 45-P7255 | For antibiotic selection after infection |
TC20 automated cell counter | Bio-Rad | For cell counting | |
X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent (Transfection Reagent 1) – 100% | Roche | 6365787001 | For virus packaging |
Yeast extract – powder | VWR | J850 | Component of LB broth |
P3000 (Transfection Reagent 3) – 100% | Life technologies | L3000008 | For transfections |