لتحديد المنظمين الرواية من عوامل النسخ، وضعنا نهجا لفحص صفيفlentiviral أو retroviral المكتبات RNAI باستخدام النسخ المزدوج القائم على luciferase. هذا النهج يوفر طريقة سريعة وغير مكلفة نسبيا لفحص مئات المرشحين في تجربة واحدة.
يمكن لعوامل النسخ تغيير التعبير عن العديد من الجينات المستهدفة التي تؤثر على مجموعة متنوعة من العمليات المصب مما يجعلها أهدافا جيدة للعلاجات المضادة للسرطان. ومع ذلك، استهداف عوامل النسخ مباشرة غالباً ما يكون صعباً ويمكن أن يسبب آثار جانبية سلبية إذا كان عامل النسخ ضروري في واحد أو أكثر من أنسجة البالغين. تحديد المنظمين المنبع التي تنشط بشكل خاطئ عوامل النسخ في الخلايا السرطانية يقدم بديلا أكثر جدوى، لا سيما إذا كانت هذه البروتينات سهلة للدواء. هنا ، نحن نصف بروتوكول يمكن استخدامه للجمع بين المكتبات المتوسطة النطاق على نطاق واسع والمكتبات ذات النسخة المزدوجة اللوسيفاز القائمة على القول لتحديد المنظمين الرواية لعوامل النسخ في الخلايا السرطانية. يقدم نهجنا طريقة سريعة وسهلة وغير مكلفة لاختبار مئات الجينات في تجربة واحدة. لإثبات استخدام هذا النهج، قمنا بإجراء شاشة مكتبة RNAI مصفّى تحتوي على العديد من المنظمين للبروتين المرتبط بنعم (YAP) والنسخ المشارك المنشط مع عزر PDZ-ملزمة (TAZ)، واثنين من المنشطات المشتركة النسخ التي هي تأثيرات المصب لمسار فرس النهر. ومع ذلك، يمكن تعديل هذا النهج لفحص المنظمين من أي عامل النسخ تقريبا أو العامل المشارك ويمكن أيضا أن تستخدم لفحص CRISPR/CAS9، cDNA، أو مكتبات ORF.
والغرض من هذا القول هو استخدام المكتبات الفيروسية لتحديد المنظمين لعوامل النسخ بطريقة سريعة نسبيا وغير مكلفة. ويرتبط النشاط النسخ الشاذ مع السرطان والانبثاث1،2،3،4،5،6، لذلك استهداف عوامل النسخ في الخلايا السرطانية هو نهج علاجي واعد. ومع ذلك، غالباً ما تكون عوامل النسخ صعبة لاستهداف الأدوية7 وكثير مطلوبة لوظيفة الخلوية العادية في أنسجة الكبار8,9,10. استهداف المسارات المرتبطة بالسرطان التي تنشط بشكل خاطئ عوامل النسخ لدفع المرض هو نهج أكثر جدوى مع احتمال أن يكون لها آثار جانبية أقل حدة. يتيح التوافر التجاري لـ RNAi أو CRISPR/CAS9 أو cDNA أو مكتبات ORF للباحثين اختبار أهمية العديد من الجينات في تجربة واحدة. ومع ذلك، يلزم قراءة موثوقة لنشاط النسخ المتغير.
هنا، نحن نصف استخدام فحص مراسل النسخ القائم على اللوسيفراز المزدوج والمكتبات المصصفوفة للصفات للبروتينات التي تنظم عوامل النسخ في الخلايا السرطانية. في هذا القول، يتم تسليم shRNAs التي تستهدف الجينات المرتبطة بالسرطان إلى الخلايا السرطانية الثديية عن طريق نقل الفيروس lentiviral ويتم اختيار الخلايا للتكامل المستقر باستخدام البورومايسين. يتم نقل الخلايا بعد ذلك مع بناء مراسل الذي يعبر عن اليراعات luciferase يقودها مروج محددة لعامل النسخ التي يجري التحقيق فيها وبناء التحكم الذي يعبر عن رينيلا luciferase من المروج نشطة بشكل تأسيسي التي لا تستجيب لعامل النسخ يجري التحقيق. نحن نبرهن على هذا النهج مع شاشة إثبات المفهوم للمنظمين من YAP و TAZ ، والآثار الحاسمة المصب لمسار فرس النهر8،10،11. نشاط غير طبيعي من YAP وTAZ يعزز عدة خطوات من سلسلة منالمنق11 ويلاحظ في العديد من أنواع السرطان11,12,13. ومع ذلك، كيف YAP وTAZ تصبح تنشيط بشكل خاطئ في بعض الخلايا السرطانية لم يفهم تماما بعد. YAP وTAZ لا تربط الحمض النووي، ولكن بدلا من ذلك يتم تجنيدهم إلى المروجين من قبل عوامل النسخ الأخرى. أعضاء عائلة مجال الشاي (TEAD) من عوامل النسخ هي الشركاء ملزمة الرئيسية لYAP وTAZ، وحاسمة بالنسبة لمعظم YAP وTAZ تعتمد على الوظائف. لدينا بناء مراسل يعبر عن luciferase اليراعات من YAP / TAZ-TEAD استجابة المروج والدراسات السابقة أظهرت أنه يكشف بأمانة التغيرات في YAP-TEAD وTAZ-TEAD نشاط النسخ2،14،15.
نهجنا سريع ومتوسط الإنتاجية، ولا يتطلب مرافق فحص، روبوتات آلية، أو تسلسل عميق للمكتبات المجمعة. التكاليف منخفضة نسبيا وهناك العديد من المكتبات المتاحة تجاريا للاختيار من بينها. كما أن المعدات والكواشف المطلوبة قياسية نسبيا في معظم المختبرات. ويمكن استخدامه لفحص المنظمين من أي عامل النسخ تقريبا إذا كان المراسل القائم على luciferase موجود أو تم إنشاؤه. نحن نستخدم هذا النهج لفحص shRNAs في الخلايا السرطانية، ولكن أي خط الخلية التي يمكن أن تكون مصابة بكفاءة معقولة يمكن استخدامها مع أي نوع من مكتبة صفيف.
في هذه الدراسة ، ونحن نظهر نهجا للفرز المتوسطة الإنتاجية للمكتبات الفيروسية مصفوفة في تركيبة مع الازدواج ية القائمة على النسخة القائمة على القول مراسل التي يمكن استخدامها لتحديد واختبار المنظمين رواية من عوامل النسخ. من الأهمية بمكان توصيف وتحسين نظام المراسل لكل خط خلية قبل أي شاشة. وين…
The authors have nothing to disclose.
ونود أن نشكر إميلي نورتون وميكايلان كوتشياري – ستوليسغروس على المساعدة في إعداد ناقلات shRNA. وقد دعم هذا العمل جزئيا ً منحة سوزان ج. كومن المحفز المهني التي منحت لـ J.M.L. (#CCR17477184).
2.0 ml 96-well deep well polypropylene plate | USA Scientific | 1896-2000 | For bacterial mini-prep |
Trypsin – 2.50% | Gibco | 15090-046 | Component of trypsin-EDTA |
96 well flat bottom white assay plate | Corning | 3922 | For dual-luciferase assay |
Ampicillin – 100 mg/ml | Sigma-Aldrich | 45-10835242001-EA | For bacterial mini-prep |
Bacto-tryptone – powder | Sigma-Aldrich | 95039 | Component of LB broth |
Dual-luciferase reporter assay system, which include LAR II reagent (reagent A), Stop & Glo substrate (reagent B substrate) and Stop & Glo buffer (reagent B buffer) – Kit | Promega | E1960 | For dual-luciferase assay |
Dulbecco's phosphate buffered saline w/o calcium, magnesium and phenol red – 9.6 g/L | Himedia | TS1006 | For PBS |
EDTA – 0.5 M | VWR | 97061-406 | Component of trypsin-EDTA |
Ethanol – 100% | Pharmco-AAPER | 111000200 | For bacterial mini-prep |
Foetal Bovine Serum – 100% | VWR | 97068-085 | Component of complete growth media |
Hexadimethrine bromide (Polybrene) – 8 mg/ml | Sigma-Aldrich | 45-H9268 | For virus infection |
HyClone DMEM/High glucose – 4 mM L-Glutamine; 4500 mg/L glucose; sodium pyruvate | GE Healthcare life sciences | SH30243.01 | Component of complete growth media |
I3-P/i3 Multi-Mode Microplate/EA | Molecular devices | For dual-luciferase assay | |
L-Glutamine – 200 mM | Gibco | 25030-081 | Component of complete growth media |
Lipofectamine 3000 (Transfection Reagent 2) – 100% | Life technologies | L3000008 | For transfections |
Molecular Biology Water – 100% | VWR | 02-0201-0500 | For dilution of shRNA vector for virus packaging |
NaCl – powder | BDH | BDH9286 | Component of LB broth |
NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo scientific | For measuring vector DNA concentration | |
Opti-MEM (Transfection Buffer) – 100% | Gibco | 31985-062 | For transfections |
Penicillin Streptomycin – 10,000 Unit/ml (Penicillin); 10,000 µg/ml (Streptomycin) | Gibco | 15140-122 | Component of complete growth media |
PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit – Kit | Thermo Fisher Scientific | K210010 | For bacterial mini-prep |
Puromycin – 2.5 mg/ml | Sigma-Aldrich | 45-P7255 | For antibiotic selection after infection |
TC20 automated cell counter | Bio-Rad | For cell counting | |
X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent (Transfection Reagent 1) – 100% | Roche | 6365787001 | For virus packaging |
Yeast extract – powder | VWR | J850 | Component of LB broth |
P3000 (Transfection Reagent 3) – 100% | Life technologies | L3000008 | For transfections |