Культура Малой колонии Вариант Pseudomonas aeruginosa и Квантитация его Alginate
Summary
Здесь мы описываем состояние роста к культуре малый вариант колонии Pseudomonas aeruginosa. Мы также описываем два отдельных метода обнаружения и количественной оценки экзополисахарида альгината производства P. aeruginosa с использованием традиционной уронической кислоты карбазол анализа и альгината конкретных моноклональных антител (mAb) основе ELISA.
Abstract
Pseudomonas aeruginosa, оппортунистический грамотрицательный бактериальный патоген, может перепроизводить экзополисахарид альгината в результате чего уникальный фенотип называется слизистой оболочки. Альгинат связан с хроническими легочными инфекциями, что приводит к плохому прогнозу у пациентов с муковисцидозом (КФ). Понимание путей, которые регулируют производство альгината может помочь в разработке новых терапевтических стратегий, направленных на альгинат формирования. Другим фенотипом, связанным с болезнью, является небольшой вариант колонии (SCV). SCV объясняется медленным ростом бактерий и часто связан с повышенной устойчивостью к противомикробным препаратам. В этой работе мы сначала показываем метод культивирования генетически определенной формы P. aeruginosa SCV из-за мутаций биосинтеза пиримидина. Дополнение азотных оснований, урацила или цитозина, возвращает нормальный рост этим мутантам, демонстрируя наличие спасительного пути, который высвобожяет свободные базы от окружающей среды. Далее мы обсудим два метода измерения бактериального альгината. Первый метод опирается на гидролиз полисахарида к его мономеру уроновой кислоты с последующим производным с хромогенным реагентом, карбазолом, в то время как второй метод использует ELISA на основе коммерчески доступного, альгината специфического mAb. Оба метода требуют стандартной кривой для количественной оценки. Мы также показываем, что иммунологический метод специфичен для алгинатной количественной оценки и может быть использован для измерения альгината в клинических образцах.
Introduction
Хронические инфекции легких с Pseudomonas aeruginosa являются основной причиной заболеваемости и смертности у пациентов с муковисцидозом (CF). В раннем детстве пациенты колонизируются несколькими бактериальными патогенами, включая немукоидные изоляты P. aeruginosa1,2. Появление небольшого варианта колонии (SCV) изолятов, а также изоляты слизистой оболочки является маркером для начала хронических инфекций. SCV изоляты высоко лекарственно устойчивы3 из-за их медленных темпов роста4, что делает их тяжелым сдерживающим фактором в лечении полков и других хронических инфекций5 P. aeruginosa. Работа Al Ahmar et al.6 показала связь между SCV и слизистой оболочкой, связанную биосинтезом de novo pyrimidine. Пиримидиновые голодания, из-за мутаций в генах, связанных с производством пиримидина, привели к phenotype SCV в немукоидном референс-напряга е PAO1 и слизистой производной, PAO581 (PAO1mucA25).
Хотя альгинат перепроизводства является важным маркером заболевания для хронических инфекций легких в CF, не ясно, есть ли прямая корреляция между количеством альгината и легочной патологии, и неясно, если альгинат может быть использован в качестве маркера прогноза для лечения7. Производство алгината в основном регулируется двумя оперонами, регулятивным опероном(algUmucABCD)8,9 и биосинтетическим опероном(algD operon)10,11. Производство alginate плотно регулируется фактором сигмы AlgU9,12 (также известный как AlgT) и деградации анти-сигма фактор MucA13. Способность контролировать выработку альгината на месте из образцов моспы пациентов может помочь в разработке новых терапевтических вариантов.
Здесь мы описываем состояние роста, которое обнаруживает наличие SCV, вызванного мутантами, которые не могут синтезировать пиримидин де Ново. Дополнение урацила и/или цитозина, азотного основания пиримидного нуклеотида, к среде активизирует спасительный путь, тем самым восстанавливая нормальный рост мутантов. Этот метод роста для этих конкретных мутантов SCV может быть использован в качестве метода скрининга для выявления пиримидиновых мутаций в образцах пациентов. Кроме того, мы обсуждаем два метода обнаружения и измерения альгината, произведенного и выделяемого P. aeruginosa. Первый метод14,15,16 деградации полисахарида с использованием высокой концентрации кислоты, а затем добавить колориметрический индикатор для количественной концентрации в образце. Второй метод, разработанный в нашей лаборатории, использует фермент-связанных иммуносорбента Ассей (ELISA) с использованием анти-альгината моноклональных антител (mAb), разработанных Зед Biosciences. Метод ELISA оказывается более конкретным и чувствительным, чем ассс ы уроническая кислота, и позволяет более безопасно использовать сяризне из-за избежания высококонцентрированной серной кислоты. С возможностью ELISA быть использованы непосредственно на образцы эмпухи пациента для измерения альгината, он может быть разработан в качестве мониторинга диагностический инструмент, чтобы следить за количество альгината присутствует в легких в разные периоды инфекции.
Protocol
Representative Results
Discussion
Оба SCV и альгинат являются важными маркерами болезни, причастных к нескольким хроническим инфекциям. Таким образом, способность расти SCV, а также изучить регулирование и производство альгината P. aeruginosa является неотъемлемой частью открытия новых методов лечения этих хронических з?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения (NIH) гранты R44GM113545 и P20GM103434.
Materials
| 1-Step Ultra TMB-ELISA | Thermo Scientific | 34028 | via Fisher Scientific |
| Absolute Ethanol (200 Proof) | Fisher Scientific | BP2818-4 | Molecular Bio-grade |
| Accu Block Digital Dry Bath | Labnet | NC0205808 | via Fisher Scientific |
| Assay Plates 96-well | CoStar | 2021-12-20 | |
| Bench Top Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | G560 | |
| Boric Acid | Research Products International Corp. | 10043-35-3 | |
| Cabinet Incubator | VWR | 1540 | |
| Carbazole | Sigma | C-5132 | |
| Carbonate-Bicarbonate Buffer | Sigma | C3041 | |
| Centrifuge Tubes (50 ml) | Fisher Scientific | 05-539-13 | via Fisher Scientific |
| Culture Test Tubes | Fisher Scientific | 14-956-6D | via Fisher Scientific |
| Cuvette Polystyrene (1.5 ml) | Fisher Scientific | 14955127 | via Fisher Scientific |
| Cytosine | Acros Organics | 71-30-7 | |
| Diposable Inoculation Loops | Fisher Scientific | 22-363-597 | |
| D-Mannuronic Acid Sodium | Sigma Aldrich | SMB00280 | |
| FMC Alginate | FMC | 2133 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP906-5 | For Molecular Biology |
| Mouse Anti-Alginate Monoclonal Antibody | QED Biosciences | N/A | Lot # :15725/15726 |
| Phosphate Buffered Saline Powder (PBS) | Sigma | P3813 | |
| Pierce Goat Anti-Mouse Poly-HRP Antibody | Thermo Scientific | 32230 | via Fisher Scientific |
| Potassium Hydroxide | Fisher Scientific | 1310-58-3 | via Fisher Scientific |
| Prism 7 | GraphPad | ||
| Pseudomonas Isolation Agar (PIA) | Difco | 292710 | via Fisher Scientific |
| Pseudomonas Isolation Broth (PIB) | Alpha Biosciences | P16-115 | via Fisher Scientific |
| Round Toothpicks | Diamond | Any brand | |
| Seaweed alginate (Protanal CR 8133) | FMC Corporation | ||
| Skim Milk | Difco | 232100 | via Fisher Scientific |
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | BioRad | 170-2525 | or preferred vendor |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma | S-5886 | |
| SpectraMax i3x Multi-mode MicroPlate Reader | Molecular Devices | i3x | or preferred vendor |
| Sterile Petri Dish 100mm x 15mm | Fisher Scientific | FB0875713 | via Fisher Scientific |
| Sulfuric Acid | Fisher Scientific | A298-212 | Technical Grade |
| Sulfuric Acid (2 Normal -Stop Solution) | R&D Systems | DY994 | |
| Tween 20 | Sigma | P2287 | |
| Uracil | Acros Organics | 66-22-8 |
References
- Govan, J. R., Deretic, V. Microbial pathogenesis in cystic fibrosis: mucoid Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cepacia. Microbiological Reviews. 60 (3), 539-574 (1996).
- Hogardt, M., Heesemann, J. Adaptation of Pseudomonas aeruginosa during persistence in the cystic fibrosis lung. International Journal of Medical Microbiology. 300 (8), 557-562 (2010).
- Evans, T. J. Small colony variants of Pseudomonas aeruginosa in chronic bacterial infection of the lung in cystic fibrosis. Future Microbiology. 10 (2), 231-239 (2015).
- Johns, B. E., Purdy, K. J., Tucker, N. P., Maddocks, S. E. Phenotypic and Genotypic Characteristics of Small Colony Variants and Their Role in Chronic Infection. Microbiology Insights. 8, 15-23 (2015).
- Pestrak, M. J., et al. Pseudomonas aeruginosa rugose small-colony variants evade host clearance, are hyper-inflammatory, and persist in multiple host environments. PLoS Pathogones. 14 (2), e1006842 (2018).
- Al Ahmar, R., Kirby, B. D., Yu, H. D. Pyrimidine Biosynthesis Regulates Small Colony Variant and Mucoidy in Pseudomonas aeruginosa Through Sigma Factor Competition. Journal of Bacteriology. 201 (1), e00575-e00618 (2019).
- Ramsey, D. M., Wozniak, D. J. Understanding the control of Pseudomonas aeruginosa alginate synthesis and the prospects for management of chronic infections in cystic fibrosis. Molecular Microbiology. 56 (2), 309-322 (2005).
- Mathee, K., McPherson, C. J., Ohman, D. E. Posttranslational control of the algT (algU)-encoded sigma22 for expression of the alginate regulon in Pseudomonas aeruginosa and localization of its antagonist proteins MucA and MucB (AlgN). Journal of Bacteriology. 179 (11), 3711-3720 (1997).
- Schurr, M. J., Yu, H., Martinez-Salazar, J. M., Boucher, J. C., Deretic, V. Control of AlgU, a member of the sigma E-like family of stress sigma factors, by the negative regulators MucA and MucB and Pseudomonas aeruginosa conversion to mucoidy in cystic fibrosis. Journal of Bacteriology. 178 (16), 4997-5004 (1996).
- Rehm, B. H. A., Rehm, B. H. A. Alginate Production: Precursor Biosynthesis, Polymerization and Secretion. Alginates: Biology and Applications. , 55-71 (2009).
- Remminghorst, U., Rehm, B. H. Bacterial alginates: from biosynthesis to applications. Biotechnology Letters. 28 (21), 1701-1712 (2006).
- Potvin, E., Sanschagrin, F., Levesque, R. C. Sigma factors in Pseudomonas aeruginosa. FEMS Microbiology Reviews. 32 (1), 38-55 (2008).
- Damron, F. H., Goldberg, J. B. Proteolytic regulation of alginate overproduction in Pseudomonas aeruginosa. Molecular Microbiology. 84 (4), 595-607 (2012).
- Bowness, J. M. Application of the carbazole reaction to the estimation of glucuronic acid and flucose in some acidic polysaccharides and in urine. The Biochemical Journal. 67 (2), 295-300 (1957).
- Fazio, S. A., Uhlinger, D. J., Parker, J. H., White, D. C. Estimations of uronic acids as quantitative measures of extracellular and cell wall polysaccharide polymers from environmental samples. Applied Environmental Microbiology. 43 (5), 1151-1159 (1982).
- Knutson, C. A., Jeanes, A. A new modification of the carbazole analysis: application to heteropolysaccharides. Analytical Biochemistry. 24 (3), 470-481 (1968).
