Cultura de Variante de Pequena Colônia de Pseudomonas aeruginosa e Quantitação de seu Alginate
Summary
Aqui, descrevemos uma condição de crescimento para cultivar a pequena variante colônia de Pseudomonas aeruginosa. Descrevemos também dois métodos separados para a detecção e quantitação do alginato exopolissacarídeo produzido por P. aeruginosa usando um ensaio tradicional de carbazol ácido urônico e um anticorpo monoclonal específico de alginato (mAb) baseado em ELISA.
Abstract
Pseudomonas aeruginosa, um patógeno bacteriano gram-negativo oportunista, pode produzir um alginato exopolissacarídeo resultando em um fenótipo único chamado mucoidy. Alginate está ligado a infecções pulmonares crônicas que resultam em mau prognóstico em pacientes com fibrose cística (CF). Entender os caminhos que regulam a produção de alginato pode auxiliar no desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas voltadas para a formação alginada. Outro fenótipo relacionado à doença é a variante da pequena colônia (CvS). O SCV deve-se ao lento crescimento das bactérias e muitas vezes associado ao aumento da resistência aos antimicrobianos. Neste artigo, mostramos pela primeira vez um método de culturing uma forma geneticamente definida de P. aeruginosa SCV devido a mutações biosíntese pirimidinas. A suplementação de bases nitrogenadas, uracil ou citosina, retorna o crescimento normal a esses mutantes, demonstrando a presença de um caminho de resgate que recolhe bases livres do meio ambiente. Em seguida, discutimos dois métodos para a medição de alginato bacteriano. O primeiro método conta com a hidrólise do polissacarídeo ao seu momero ácido urônico seguido de derivatização com um reagente cromosgênico, carbazol, enquanto o segundo método usa um ELISA baseado em um mAb comercialmente disponível, específico para alginato. Ambos os métodos requerem uma curva padrão para quantitação. Mostramos também que o método imunológico é específico para quantificação de alginato e pode ser usado para a medição de alginato nos espécimes clínicos.
Introduction
As infecções pulmonares crônicas com Pseudomonas aeruginosa são uma das principais causas de morbidade e mortalidade em pacientes com fibrose cística (CF). Durante a primeira infância, os pacientes são colonizados por múltiplos patógenos bacterianos, incluindo isolados não mucoides de P. aeruginosa1,2. O surgimento da variante da pequena colônia (SCV) isola, bem como isolados mucoides é um marcador para o início das infecções crônicas. Os isolados de SCV são altamente resistentes a medicamentos3 devido às suas lentas taxas de crescimento4, o que lhes torna um severo impedimento nos regimentos de tratamento e outras infecções crônicas5 por P. aeruginosa. O trabalho de Al Ahmar et al.6 mostrou uma ligação entre SCV e mucoidy ligada pela biossíntese de novo pirimidina. A fome de pirimidina, devido a mutações em genes envolvidos com a produção de pirimidina, resultou em fenótipo SCV na cepa de referência não mucoide PAO1 e o derivado mucoide, PAO581 (PAO1mucA25).
Embora a superprodução alginada seja um importante marcador de doença para infecções pulmonares crônicas na CF, não está claro se há uma correlação direta entre a quantidade de alginato e patologia pulmonar, e não está claro se alginato pode ser usado como um marcador de prognóstico para o tratamento7. A produção de alginate é regulada principalmente por dois operões, um operon regulatório (algUmucABCD)8,9 e o operon biossintético (algD operon)10,11. A produção de alginate é fortemente regulada pelo fator Sigma AlgU9,12 (também conhecido como AlgT) e pela degradação do fator antissigma MucA13. A capacidade de monitorar a produção de alginato in situ a partir dos espécimes de sputum dos pacientes pode auxiliar no desenvolvimento de novas opções terapêuticas.
Aqui, descrevemos uma condição de crescimento que detecta a presença de SCV causada por mutantes que não podem sintetizar a pirimidina de novo. A suplementação do uracil e/ou citosina, a base nitrogenada do nucleotídeo pirimidino, ao meio ativa o caminho de salvamento, restaurando assim o crescimento normal dos mutantes. Este método de crescimento para esses mutantes SCV específicos pode ser usado como um método de triagem para identificar mutações de pirimidina em amostras de pacientes. Além disso, discutimos dois métodos de detecção e medição de alginato produzido e secretado por P. aeruginosa. O primeiro é o método tradicional14,15,16 de degradar o polissacarídeo usando uma alta concentração de ácido e, em seguida, adicionando um indicador colorimétrico para quantitar a concentração na amostra. O segundo método, desenvolvido em nosso laboratório, utiliza o Enzima-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) usando um anticorpo monoclonal antialginato (mAb) desenvolvido pela QED Biosciences. O método ELISA se mostra mais específico e sensível do que o ensaio ácido urônico e permite um uso mais seguro devido à evitação do ácido sulfúrico altamente concentrado. Com a capacidade da ELISA de ser usada diretamente em amostras de sputum paciente para medir alginato, ele pode ser desenvolvido como uma ferramenta de diagnóstico de monitoramento para acompanhar a quantidade de alginato presente nos pulmões em diferentes períodos da infecção.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tanto o SCV quanto o alginato são importantes marcadores de doençaimplicados em várias infecções crônicas. Portanto, a capacidade de cultivar SCV, bem como estudar a regulação e produção de alginato por P. aeruginosa é parte integrante da descoberta de novos tratamentos para essas doenças crônicas.
As cepas de SCV são notoriamente difíceis de crescer devido à sua lenta taxa de crescimento4 em comparação com outras cepas p. aeruginosa,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho contou com o apoio dos subsídios r44GM113545 e P20GM1034344.
Materials
| 1-Step Ultra TMB-ELISA | Thermo Scientific | 34028 | via Fisher Scientific |
| Absolute Ethanol (200 Proof) | Fisher Scientific | BP2818-4 | Molecular Bio-grade |
| Accu Block Digital Dry Bath | Labnet | NC0205808 | via Fisher Scientific |
| Assay Plates 96-well | CoStar | 2021-12-20 | |
| Bench Top Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | G560 | |
| Boric Acid | Research Products International Corp. | 10043-35-3 | |
| Cabinet Incubator | VWR | 1540 | |
| Carbazole | Sigma | C-5132 | |
| Carbonate-Bicarbonate Buffer | Sigma | C3041 | |
| Centrifuge Tubes (50 ml) | Fisher Scientific | 05-539-13 | via Fisher Scientific |
| Culture Test Tubes | Fisher Scientific | 14-956-6D | via Fisher Scientific |
| Cuvette Polystyrene (1.5 ml) | Fisher Scientific | 14955127 | via Fisher Scientific |
| Cytosine | Acros Organics | 71-30-7 | |
| Diposable Inoculation Loops | Fisher Scientific | 22-363-597 | |
| D-Mannuronic Acid Sodium | Sigma Aldrich | SMB00280 | |
| FMC Alginate | FMC | 2133 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP906-5 | For Molecular Biology |
| Mouse Anti-Alginate Monoclonal Antibody | QED Biosciences | N/A | Lot # :15725/15726 |
| Phosphate Buffered Saline Powder (PBS) | Sigma | P3813 | |
| Pierce Goat Anti-Mouse Poly-HRP Antibody | Thermo Scientific | 32230 | via Fisher Scientific |
| Potassium Hydroxide | Fisher Scientific | 1310-58-3 | via Fisher Scientific |
| Prism 7 | GraphPad | ||
| Pseudomonas Isolation Agar (PIA) | Difco | 292710 | via Fisher Scientific |
| Pseudomonas Isolation Broth (PIB) | Alpha Biosciences | P16-115 | via Fisher Scientific |
| Round Toothpicks | Diamond | Any brand | |
| Seaweed alginate (Protanal CR 8133) | FMC Corporation | ||
| Skim Milk | Difco | 232100 | via Fisher Scientific |
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | BioRad | 170-2525 | or preferred vendor |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma | S-5886 | |
| SpectraMax i3x Multi-mode MicroPlate Reader | Molecular Devices | i3x | or preferred vendor |
| Sterile Petri Dish 100mm x 15mm | Fisher Scientific | FB0875713 | via Fisher Scientific |
| Sulfuric Acid | Fisher Scientific | A298-212 | Technical Grade |
| Sulfuric Acid (2 Normal -Stop Solution) | R&D Systems | DY994 | |
| Tween 20 | Sigma | P2287 | |
| Uracil | Acros Organics | 66-22-8 |
References
- Govan, J. R., Deretic, V. Microbial pathogenesis in cystic fibrosis: mucoid Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cepacia. Microbiological Reviews. 60 (3), 539-574 (1996).
- Hogardt, M., Heesemann, J. Adaptation of Pseudomonas aeruginosa during persistence in the cystic fibrosis lung. International Journal of Medical Microbiology. 300 (8), 557-562 (2010).
- Evans, T. J. Small colony variants of Pseudomonas aeruginosa in chronic bacterial infection of the lung in cystic fibrosis. Future Microbiology. 10 (2), 231-239 (2015).
- Johns, B. E., Purdy, K. J., Tucker, N. P., Maddocks, S. E. Phenotypic and Genotypic Characteristics of Small Colony Variants and Their Role in Chronic Infection. Microbiology Insights. 8, 15-23 (2015).
- Pestrak, M. J., et al. Pseudomonas aeruginosa rugose small-colony variants evade host clearance, are hyper-inflammatory, and persist in multiple host environments. PLoS Pathogones. 14 (2), e1006842 (2018).
- Al Ahmar, R., Kirby, B. D., Yu, H. D. Pyrimidine Biosynthesis Regulates Small Colony Variant and Mucoidy in Pseudomonas aeruginosa Through Sigma Factor Competition. Journal of Bacteriology. 201 (1), e00575-e00618 (2019).
- Ramsey, D. M., Wozniak, D. J. Understanding the control of Pseudomonas aeruginosa alginate synthesis and the prospects for management of chronic infections in cystic fibrosis. Molecular Microbiology. 56 (2), 309-322 (2005).
- Mathee, K., McPherson, C. J., Ohman, D. E. Posttranslational control of the algT (algU)-encoded sigma22 for expression of the alginate regulon in Pseudomonas aeruginosa and localization of its antagonist proteins MucA and MucB (AlgN). Journal of Bacteriology. 179 (11), 3711-3720 (1997).
- Schurr, M. J., Yu, H., Martinez-Salazar, J. M., Boucher, J. C., Deretic, V. Control of AlgU, a member of the sigma E-like family of stress sigma factors, by the negative regulators MucA and MucB and Pseudomonas aeruginosa conversion to mucoidy in cystic fibrosis. Journal of Bacteriology. 178 (16), 4997-5004 (1996).
- Rehm, B. H. A., Rehm, B. H. A. Alginate Production: Precursor Biosynthesis, Polymerization and Secretion. Alginates: Biology and Applications. , 55-71 (2009).
- Remminghorst, U., Rehm, B. H. Bacterial alginates: from biosynthesis to applications. Biotechnology Letters. 28 (21), 1701-1712 (2006).
- Potvin, E., Sanschagrin, F., Levesque, R. C. Sigma factors in Pseudomonas aeruginosa. FEMS Microbiology Reviews. 32 (1), 38-55 (2008).
- Damron, F. H., Goldberg, J. B. Proteolytic regulation of alginate overproduction in Pseudomonas aeruginosa. Molecular Microbiology. 84 (4), 595-607 (2012).
- Bowness, J. M. Application of the carbazole reaction to the estimation of glucuronic acid and flucose in some acidic polysaccharides and in urine. The Biochemical Journal. 67 (2), 295-300 (1957).
- Fazio, S. A., Uhlinger, D. J., Parker, J. H., White, D. C. Estimations of uronic acids as quantitative measures of extracellular and cell wall polysaccharide polymers from environmental samples. Applied Environmental Microbiology. 43 (5), 1151-1159 (1982).
- Knutson, C. A., Jeanes, A. A new modification of the carbazole analysis: application to heteropolysaccharides. Analytical Biochemistry. 24 (3), 470-481 (1968).
