슈도모나스 녹농균의 작은 식민지 변형의 문화와 알긴산의 정량화
Summary
여기서, 우리는 녹농균의 작은 식민지 변종을 배양하는 성장 상태를 설명한다. 우리는 또한 전통적인 우론산 카르바졸 분석및 알긴산 특이적 단일클론 항체(mAb) 기반 ELISA를 사용하여 P. aeruginosa에 의해 생성된 외다당류 알긴산의 검출 및 정량화를 위한 2개의 개별적인 방법을 기술한다.
Abstract
기회 그람 음성 세균성 병원균인 슈도모나스 녹농균은점막이라는 독특한 표현형을 초래하는 외다당류 알긴산을 과잉 생산할 수 있습니다. Alginate는 낭포성 섬유증 (CF)를 가진 환자에 있는 나쁜 예후 귀착되는 만성 폐 감염에 연결됩니다. 알긴산의 생산을 조절하는 경로를 이해하면 알긴산 형성을 대상으로 하는 새로운 치료 전략의 개발에 도움이 될 수 있습니다. 또 다른 질병 관련 표현형은 작은 콜로니 변이체(SCV)이다. SCV는 박테리아의 느린 성장 및 종종 항균제에 증가 저항과 관련. 이 논문에서, 우리는 먼저 피리미딘 생합성 돌연변이로 인해 유전적으로 정의 된 형태의 P. aeruginosa SCV를 배양하는 방법을 보여줍니다. 질소 염기, 우라실 또는 시토신의 보충은 이러한 돌연변이체에 정상적인 성장을 반환하여 환경으로부터 자유 염기를 청소하는 인양 통로의 존재를 보여줍니다. 다음으로, 우리는 세균성 알긴산의 측정을 위한 2개의 방법을 토론합니다. 첫 번째 방법은 다당류의 가수분해를 그것의 우론산 단량체에 의존하고 염색체 시약, 카르바졸로 유도하는 반면, 두 번째 방법은 시판되는 알긴산 특이적 mAb에 기초한 ELISA를 사용한다. 두 방법 모두 정량화에 대한 표준 곡선이 필요합니다. 우리는 또한 면역학적 방법이 알긴산 정량화를 위해 특이적이고 임상 구편에서 알긴산의 측정을 위해 사용될 수 있음을 보여준다.
Introduction
녹농균을 가진 만성 폐 감염은 낭포성 섬유증 (CF)를 가진 환자에 있는 이환율 그리고 사망의 중요한 원인입니다. 초기 유년기 도중, 환자는 P. aeruginosa1,2의비 점막 격리를 포함하여 다중 세균성 병원체에 의해 식민지화됩니다. 작은 식민지 변이체 (SCV)의 출현은 점막 분리뿐만 아니라 분리만성 감염에 발병을위한 마커이다. SCV 분리제는 그들의 느린 성장 속도4때문에 높게 약 저항하는3, 그(것)들을 치료 연대 및 그밖 만성 감염에 있는 가혹한 억지력을 렌더링합니다5 에 의하여 P. aeruginosa. Al Ahmar 외6에 의한 작업은 de novo 피리미딘 생합성에 의해 연결된 SCV와 점막 사이의 연관성을 보여주었다. 피리미딘 기아는, 피리미딘 생산과 관련된 유전자의 돌연변이로 인해, 비점막 기준 균주 PAO1 및 점막 유도체, PAO581 (PAO1mucA25)에서 SCV 표현형을 초래하였다.
알긴산 과잉 생산은 CF에서 만성 폐 감염에 대한 중요한 질병 마커임에도 불구하고, 알긴산과 폐 병리학의 양 사이에 직접적인 상관관계가 있는지 는 명확하지 않으며, 알긴산이 치료를 위한 예후 마커로 사용될 수 있는지는 불분명하다7. 알긴산 생산은 주로 2개의 오페론, 조절오페론(algUmucABCD)8,9 및 생합성 오페론(algD operon) 10,11에의해 조절된다. 알긴산 생산은 시그마 인자 AlgU9,12(일명 AlgT라고도 함)와 반시그마 인자 MucA13의분해에 의해 엄격하게 조절된다. 환자의 가래 표본에서 즉석에서 알긴산의 생산을 모니터링하는 능력은 새로운 치료 옵션의 개발에 도움이 될 수 있습니다.
여기서, 우리는 피리미딘 드 노보를 합성할 수 없는 돌연변이체에 의한 SCV의 존재를 검출하는 성장 조건을 기술한다. 피리미딘 뉴클레오티드의 질소 염기인 우라실 및/또는 시토신을 보충하여 인양 경로를 활성화시켜 돌연변이체의 정상적인 성장을 회복시다. 이들 특정 SCV 돌연변이체에 대한 이러한 성장 방법은 환자 샘플에서 피리미딘 돌연변이를 식별하는 스크리닝 방법으로 사용될 수 있다. 또한, 우리는 P. aeruginosa에의해 생성되고 분비되는 알긴산의 검출 및 측정을위한 두 가지 방법에 대해 논의합니다. 첫 번째는 고농도의 산을 이용하여 다당류를 분해한 다음 시료의 농도를 정량화하기 위해 색도 지표를 첨가하는 전통적인 방법14,15,16이다. 우리의 실험실에서 개발 된 두 번째 방법은 QED 바이오 사이언스가 개발 한 항 알긴산 단일 클론 항체 (mAb)를 사용하여 효소 연결 면역 흡착 분석 (ELISA)을 활용합니다. ELISA 방법은 우론산 분석법보다 더 구체적이고 민감하며 고농축 황산의 회피로 인해 보다 안전한 사용을 가능하게 합니다. Alginate를 측정하기 위하여 참을성 있는 가래 견본에 직접 이용되는 ELISA의 기능으로, 감염의 다른 기간에 폐에 존재하는 알긴산의 양을 따르는 감시 진단 공구로 개발될 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
SCV와 알긴산은 모두 몇몇 만성 감염에서 연루된 중요한 질병 마커입니다. 따라서, SCV를 성장시킬 뿐만 아니라 P. aeruginosa에 의한 알긴산의 조절 및 생산을 연구하는 능력은 이러한 만성 질환에 대한 새로운 치료법의 발견에 필수적이다.
SCV 균주는 다른 P. aeruginosa 균주에 비해 느린 성장속도 4로 인해 성장하기가 악명 이어, 이는 그들의 항균 저항…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 건강의 국가 학회에 의해 지원 되었다 (NIH) 보조금 R44GM1113545 및 P20GM103434.
Materials
| 1-Step Ultra TMB-ELISA | Thermo Scientific | 34028 | via Fisher Scientific |
| Absolute Ethanol (200 Proof) | Fisher Scientific | BP2818-4 | Molecular Bio-grade |
| Accu Block Digital Dry Bath | Labnet | NC0205808 | via Fisher Scientific |
| Assay Plates 96-well | CoStar | 2021-12-20 | |
| Bench Top Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | G560 | |
| Boric Acid | Research Products International Corp. | 10043-35-3 | |
| Cabinet Incubator | VWR | 1540 | |
| Carbazole | Sigma | C-5132 | |
| Carbonate-Bicarbonate Buffer | Sigma | C3041 | |
| Centrifuge Tubes (50 ml) | Fisher Scientific | 05-539-13 | via Fisher Scientific |
| Culture Test Tubes | Fisher Scientific | 14-956-6D | via Fisher Scientific |
| Cuvette Polystyrene (1.5 ml) | Fisher Scientific | 14955127 | via Fisher Scientific |
| Cytosine | Acros Organics | 71-30-7 | |
| Diposable Inoculation Loops | Fisher Scientific | 22-363-597 | |
| D-Mannuronic Acid Sodium | Sigma Aldrich | SMB00280 | |
| FMC Alginate | FMC | 2133 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP906-5 | For Molecular Biology |
| Mouse Anti-Alginate Monoclonal Antibody | QED Biosciences | N/A | Lot # :15725/15726 |
| Phosphate Buffered Saline Powder (PBS) | Sigma | P3813 | |
| Pierce Goat Anti-Mouse Poly-HRP Antibody | Thermo Scientific | 32230 | via Fisher Scientific |
| Potassium Hydroxide | Fisher Scientific | 1310-58-3 | via Fisher Scientific |
| Prism 7 | GraphPad | ||
| Pseudomonas Isolation Agar (PIA) | Difco | 292710 | via Fisher Scientific |
| Pseudomonas Isolation Broth (PIB) | Alpha Biosciences | P16-115 | via Fisher Scientific |
| Round Toothpicks | Diamond | Any brand | |
| Seaweed alginate (Protanal CR 8133) | FMC Corporation | ||
| Skim Milk | Difco | 232100 | via Fisher Scientific |
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | BioRad | 170-2525 | or preferred vendor |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma | S-5886 | |
| SpectraMax i3x Multi-mode MicroPlate Reader | Molecular Devices | i3x | or preferred vendor |
| Sterile Petri Dish 100mm x 15mm | Fisher Scientific | FB0875713 | via Fisher Scientific |
| Sulfuric Acid | Fisher Scientific | A298-212 | Technical Grade |
| Sulfuric Acid (2 Normal -Stop Solution) | R&D Systems | DY994 | |
| Tween 20 | Sigma | P2287 | |
| Uracil | Acros Organics | 66-22-8 |
References
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