Kanser Tedavisi için Sitotoksik Sitokin Kaynaklı Katil T Hücrelerinin İzolasyon ve Genişlemesi

Summary

Burada periferik kan mononükleer hücrelerinin izolasyon ve genleşmesini gerçekleştirmek için bir protokol sunmaktayız- periferik kan mononükleer hücrelerden türetilmiş sitokin kaynaklı CD3⁺CD56⁺ öldürücü hücreler ve in vitro tanı akış sitometri sistemi kullanarak hematolojik ve katı kanser hücrelerine karşı sitotoksisite etkilerini göstermek.

Abstract

Benimseyen hücresel immünoterapi bağışıklık sistemi üzerinden kanser tanıma geri odaklanır ve etkili tümör hücre öldürme geliştirir. Sitokin kaynaklı katil (CIK) T hücre tedavisi kanser hücrelerine karşı önemli sitotoksik etkileri uygulamak ve kanser tedavilerinde cerrahi, radyasyon ve kemoterapi nin olumsuz etkilerini azaltmak için bildirilmiştir. CIK periferik kan mononükleer hücreleri (PBMCs), kemik iliği ve göbek kordon kanı elde edilebilir. CIK hücreleri CD3⁺CD56⁺ ve doğal öldürücü (NK) fenotipik özellikleri ile T hücrelerinin heterojen bir alt popülasyonudur ve majör histokompatibilite kompleksi (MHC)-sınırsız antitümör aktivitesi içerir. Bu çalışmada PBMC kaynaklı CIK hücrelerinin hematolojik ve katı kanser hücrelerine karşı sitolitik yeteneğinin nicelleştirilmesi için klinik olarak uygulanabilir, akış sitometrisi esaslı bir yöntem açıklanmaktadır. Sitiyolitik sitalöz deyiş, CIK hücreleri prestained hedef tümör hücreleri ile farklı oranlarda birlikte inkübe edilir. Kuluçka döneminden sonra, hedef hücrelerin sayısı ölü hücreleri tespit etmek için nükleik asit bağlayıcı bir leke ile belirlenir. Bu yöntem hem araştırma hem de tanı uygulamaları için geçerlidir. CIK hücreleri, sitometre kurulumu ve takibi (CS & T) tabanlı akış sitometri sistemi ile klinik öncesi değerlendirme sonucunda kanser tedavisi için alternatif bir strateji olarak keşfilebilen güçlü sitotoksisiteye sahiptir.

Introduction

Sitotoksik T lenfositler kansere karşı bağışıklık yanıtları aracılık belirli bir bağışıklık efektörü hücre popülasyonuvardır. Lenfokin aktive katil (LAK) hücreleri, tümöre infiltrasyon lu lenfositler (TILs), doğal öldürücü (NK) hücreleri, γδ T hücreleri ve sitokin kaynaklı öldürücü (CIK) hücreleri de dahil olmak üzere çeşitli efektör hücre popülasyonları benimseyen T hücre tedavisi (ACT)^amaçlarıiçin geliştirilmiştir 1 . Cik hücrelerine artan bir ilgi vardır, çünkü otolog periferik kan mononükleer hücrelerden (PMBCs) 2’ye kadargenişlemiş sitokin kaynaklı sitotoksik hücre popülasyonlarının bir karışımını temsil ederler.

Lenfoid progenitor hücrelerinin kontrolsüz büyüme, miyeloblastlar, ve lenfoblastlar kan kanserlerinin üç ana türüne yol açar (yani, lösemi, lenfoma, ve miyelom), katı tümörler, karsinomlar dahil (örneğin, akciğer kanseri, mide kanseri, servikal kanser), ve sarkomlar, diğer kanserler arasında³. CIK hücreleri büyük histokompatibilite kompleksi geniş bir yelpazede sergileyen hücre popülasyonlarının bir karışımıdır (MHC)-sınırsız antitümör aktivitesi ve böylece hematolojik ve ileri tümörlerin tedavisi için söz tutun^4,5,6,7. CIK hücreleri, T hücreleri (CD3⁺CD56⁻), NK-T hücreleri (CD3⁺CD56^{+ )}ve NK hücreleri (CD3^–CD56^{+ )}dahil olmak üzere hücrelerin bir birleşimini oluşturur. IFN-γ, anti-CD3 antikor ve IL-2 eklenmesi için sabit bir program kullanarak CIK indüksiyon protokolünün optimizasyonu, CIK hücrelerinin genişlemesiile sonuçlanır⁸. Kanser hücrelerine karşı CIK hücrelerinin sitotoksik yeteneği esas olarak NK grup 2 üyesi D (C-tipi lektin benzeri reseptör ailesinin bir üyesi) Tümör hücreleri üzerinde NKG2D ligands nişan bağlıdır, ve perforin aracılı yollar⁹. Preklinik bir çalışmanın sonuçları IL-15-uyarılmış CIK hücrelerinin primer ve akut miyeloid lösemi hücre hatlarına infeksiyöz güçlü sitotoksisite indüklediği ve normal PBMC’lere ve fibroblastlara karşı daha düşük alloreaktivite sergilediği ni saptandı⁹. Son zamanlarda faz II klinik çalışmada miyeloid neoplazm tedavisi için nonmiyeloablatif allojeneik transplantasyon sonrası konsolidasyon olarak bir kerelik sağlıklı donör kaynaklı CIK (1 x 10⁸/kg CD3⁺ hücre) infüzyonunun sonucu^{yayınlanmıştır.}

Bu çalışmada, CIK üretimini artırmak için hematopoetik hücre ortamına IFN-γ, IL-1α, anti-CD3 antikor ve IL-2’den oluşan optimize edilmiş bir hücre kültürü formülü geliştirdik ve CIK hücrelerinin insan kroniklerine karşı sitotoksik etkisini araştırdık. miyeloid lösemi (K562) hücreleri ve yumurtalık kanseri (OC-3) hücreleri.

Protocol

Klinik protokol çin Tıp Üniversitesi ve Hastane Araştırma Etik Komitesi Kurumsal İnceleme Kurulu yönergelerine uygun olarak yapıldı ve onaylandı. Periferik kan örnekleri sağlıklı gönüllülerden bilgilendirilmiş rızaları ile alındı. 1. Malzemelerin hazırlanması Malzeme Güvenliği Veri Formu’nda (MSDS) gösterildiği şekilde reaktifleri, antikorları ve kimyasalları depolayın. İlaçları veya sitokinleri çözücülerde stok çözeltisi olarak çözün ve da…

Representative Results

Bu protokolün amacı, sitokin kaynaklı katil (CIK) T hücrelerini periferik kan monositlerinden izole etmek ve genişletmek ve CIK’in hematolojik malignite ve katı kanser hücrelerine karşı sitotoksik etkisini değerlendirmektir. CIK indüksiyonu CD3/CD56 tanıma ile tanımlanmıştır. Şekil 1A, CIK indüksiyonu ve genişlemesi için protokolü gösterir. Sağlıklı donörlerden CD3+CD56+ T hücrelerinin alt popülasyonunun analiz ine yönelik g…

Discussion

Açıklanan yöntem, sağlıklı donörlerin tam kan örneklerinden sitotoksik sitokin kaynaklı katil (CIK) T hücrelerinin izole edilmesi ve genişlemesi için hızlı, kullanışlı ve güvenilir bir protokoldür. Ayrıca bir akış sitometri kurulum ve izleme (CS & T) sistemi kullanarak lösemi (K562) ve yumurtalık kanseri hücrelerine (OC-3) karşı CIK sitotoksik etkisini gösterir. CIK hücreleri iyi fabrikauygulamaları (GMP) koşullarında GMP dereceli sitokinler ve daha ileri klinik infüzyon için serumsuz or…

Materials

7-Amino Actinomycin D	BD	559925
APC Mouse Anti-Human CD56 antibody	BD	555518	B159
APC Mouse IgG1, κ Isotype Control	BD	555751	MOPC-21
BD FACSCanto II Flow Cytometer	BD	338962		SN: R33896202856
Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE)	BD	565082		Reconstritution of CFSE dye (500 mg) with 90 mL of DMSO
D-(+)-Glucose solution	SIGMA	G8644		For K562 cell culture. Add 12.5 mL to 500 mL of complete medium
Dulbecco's Modified Eagle Medium/F12	HyClone	SH30023.02		Basal medium for OC-3 cell culture
Fetal bovine serum	HyClone	SH30084.03		For K562 and OC-3 cell culture. Complete medium contains 10% of FBS
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare Life Sciences	71101700-EK		Density gradient solution
FITC Mouse Anti-Human CD3 antibody	BD	555332	UCHT1
FITC Mouse IgG1, κ Isotype Control	BD	555748	MOPC-21
Human anti-CD3 mAb	TaKaRa	T210	OKT3	Add 2.5 mL of stock (1 mg/1 mL) to 50 mL of Induction medium. Storage stock at -80 °C
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122		Add 5 mL of stock (10,000 U/mL) to 500 mL of complete medium. Storage stock at 4 °C.
Proleukin	NOVARTIS			Reconstitution of Proleukin Powder (22×106 IU) with 1.2 mL of sterile water and add 2.7 mL to 50 mL of Induction medium. Storage stock at -20 °C
Recombinant Human Interferon-gamma	CellGenix	1425-050		Reconstitution of rh IFN-g (5×105 IU/50 µg) with 200 µL of sterile water and add 20 mL to 50 mL of Induction medium. Storage stock at -20 °C
Recombinant Human Interleukin-1 alpha	PEPROTECH	200-01A		Reconstitution rh IL-1α (10 µg) with 1 mL of sterile water and add 5 mL to 50 mL of Induction medium. Storage stock at -20 °C
RPMI1640 medium	Gibco	11875-085		Basal medium for K562 cell culture. Storage stock at 4 °C
Sigma 3-18K Centrifuge	Sigma	10295
TrypLE Express Enzyme	Gibco	12605028		Cell dissociation enzyme; For deattachment of adheren cells. Storage at room temperature
X-VIVO 15 medium	Lonza	04-418Q		Basal medium for PBMC and CIK cells. Storage at 4 °C