在这里,我们提出一个协议,以执行外周血单核细胞衍生细胞诱导CD3 + CD56+杀伤细胞的分离和膨胀,并说明其细胞毒性对血液和固体癌细胞的影响,通过使用体外诊断流细胞测定系统。
采用的细胞免疫疗法侧重于通过免疫系统恢复癌症识别,并改善有效的肿瘤细胞杀灭。据报道,细胞因子诱导杀手(CIK)T细胞疗法对癌细胞产生显著的细胞毒性作用,并减少手术、放疗和化疗在癌症治疗中的不利影响。CIK可以从外周血单核细胞(PBMC)、骨髓和脐带血中提取。CIK细胞是具有CD3+CD56+和天然杀伤性(NK)型型特征的T细胞的异构亚群,包括主要组织相容性复合物(MHC)-无限制抗肿瘤活性。本研究描述了一种合格的、临床上适用的流式细胞学方法,用于定量PBMC衍生CIK细胞的细胞解解能力,对抗血液学和固体癌细胞。在细胞解物测定中,CIK细胞与预染色靶肿瘤细胞以不同比例共同孵育。潜伏期后,目标细胞的数量由核酸结合染色确定,以检测死细胞。该方法适用于研究和诊断应用。CIK 细胞具有强效细胞毒性,通过基于 CS 和 T 的流式细胞测定系统进行临床前评估后,可探索为癌症治疗的替代策略。
细胞毒性T淋巴细胞是一种特定的免疫效应细胞群,用于调节对癌症的免疫反应。包括淋巴素激活杀伤性(LAK)细胞、肿瘤渗透淋巴细胞(TLL)、自然杀伤细胞(NK)细胞、βT细胞和细胞因子诱导杀伤细胞(CIK)细胞在内的几种效应细胞群已开发用于采用T细胞治疗(ACT)目的1。人们对CIK细胞的兴趣日益浓厚,因为它们代表了细胞因子引起的细胞毒性细胞群的混合物,这些细胞群从自体外周血单核细胞(PMBC)2中扩展。
淋巴原细胞、骨髓细胞和淋巴细胞的无控制生长导致三种主要类型的血癌(即白血病、淋巴瘤和骨髓瘤)、实体肿瘤,包括癌瘤(如肺癌、胃癌、宫颈癌)和肉瘤等癌症3。CIK细胞是细胞群的混合物,表现出广泛的主要组织相容性复合物(MHC)-不受限制的抗肿瘤活性,从而有望治疗血液学和晚期肿瘤4,5,6,7。CIK细胞包括细胞的组合,包括T细胞(CD3+CD56+)、NK-T细胞(CD3+CD56+)和NK细胞(CD3+CD56+)。通过使用固定的时间表来添加IFN-α、抗CD3抗体和IL-2,优化CIK诱导协议,导致CIK细胞8的膨胀。CIK细胞对癌细胞的细胞毒性主要取决于NK组2成员D(C型叶酸样受体家族成员)对肿瘤细胞的NKG2D配体和穿孔素介导途径9的活性。临床前研究结果表明,IL-15刺激CIK细胞在体外诱导强效细胞毒性对原发性及急性骨髓性白血病细胞系,对正常PBMC和成纤维细胞9表现出较低的感化活性。最近,在II期临床研究中,一次性健康供体衍生CIK(1 x 108/kgCD3+细胞)输注作为骨髓异体肿瘤治疗非骨髓异体移植的合并结果发表于10。
在本研究中,我们开发了由IFN-α、IL-1+、抗CD3抗体和IL-2添加到造血细胞培养基中增加CIK产量的优化细胞培养公式,并研究了CIK细胞对人体慢性的细胞毒性作用骨髓性白血病(K562)细胞和卵巢癌(OC-3)细胞。
所述方法是一种快速、方便、可靠的方案,用于从健康献血者全血样本中分离和扩增细胞毒性细胞因子(CIK)T细胞。它还显示了CIK对白血病(K562)和卵巢癌细胞(OC-3)的细胞毒性作用,使用流式细胞仪设置和跟踪(CS & T)系统。CIK细胞可以通过GMP级细胞因子和无血清培养基在良好的生产实践(GMP)条件下诱导和扩大,以进一步临床输注11。然而,CIK诱导和扩张的功效表现出个?…
The authors have nothing to disclose.
这项研究得到了中国医科大学附属医院(DMR-Cell-1809)的支持。
7-Amino Actinomycin D | BD | 559925 | ||
APC Mouse Anti-Human CD56 antibody | BD | 555518 | B159 | |
APC Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD | 555751 | MOPC-21 | |
BD FACSCanto II Flow Cytometer | BD | 338962 | SN: R33896202856 | |
Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) | BD | 565082 | Reconstritution of CFSE dye (500 mg) with 90 mL of DMSO | |
D-(+)-Glucose solution | SIGMA | G8644 | For K562 cell culture. Add 12.5 mL to 500 mL of complete medium | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium/F12 | HyClone | SH30023.02 | Basal medium for OC-3 cell culture | |
Fetal bovine serum | HyClone | SH30084.03 | For K562 and OC-3 cell culture. Complete medium contains 10% of FBS | |
Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare Life Sciences | 71101700-EK | Density gradient solution | |
FITC Mouse Anti-Human CD3 antibody | BD | 555332 | UCHT1 | |
FITC Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD | 555748 | MOPC-21 | |
Human anti-CD3 mAb | TaKaRa | T210 | OKT3 | Add 2.5 mL of stock (1 mg/1 mL) to 50 mL of Induction medium. Storage stock at -80 °C |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | Add 5 mL of stock (10,000 U/mL) to 500 mL of complete medium. Storage stock at 4 °C. | |
Proleukin | NOVARTIS | Reconstitution of Proleukin Powder (22×106 IU) with 1.2 mL of sterile water and add 2.7 mL to 50 mL of Induction medium. Storage stock at -20 °C | ||
Recombinant Human Interferon-gamma | CellGenix | 1425-050 | Reconstitution of rh IFN-g (5×105 IU/50 µg) with 200 µL of sterile water and add 20 mL to 50 mL of Induction medium. Storage stock at -20 °C | |
Recombinant Human Interleukin-1 alpha | PEPROTECH | 200-01A | Reconstitution rh IL-1α (10 µg) with 1 mL of sterile water and add 5 mL to 50 mL of Induction medium. Storage stock at -20 °C | |
RPMI1640 medium | Gibco | 11875-085 | Basal medium for K562 cell culture. Storage stock at 4 °C | |
Sigma 3-18K Centrifuge | Sigma | 10295 | ||
TrypLE Express Enzyme | Gibco | 12605028 | Cell dissociation enzyme; For deattachment of adheren cells. Storage at room temperature | |
X-VIVO 15 medium | Lonza | 04-418Q | Basal medium for PBMC and CIK cells. Storage at 4 °C |